聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸與DNA聚離子復合物膠束的研究

第26卷第4期湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol.26 No.42004年12月Joumal of Hubei Universit( Natural Science Edition )Dec.2004文章編號:1000- 23752004 )4-0322 - 05聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸與DNA聚離子復合物膠束的研究楊子剛'周芬'袁建軍'，馬立新2,翟超2程時(shí)遠'( 1.湖北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院湖北武漢A30062 2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湖北武漢A430062 )摘要將聚(N- 芐氧羰基賴(lài)氨酸)-聚乙二醇-聚( N--芐氧羰基賴(lài)氨酸I PL(Z)- PEG- PL(Z))沖的氨基去保護得到兩端為聚陽(yáng)離子的嵌段共聚物聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸( PLL- PEG- PLL)并對其與DNA結合形成的聚集體的性質(zhì)進(jìn)行了研究.結果表明:PLL- PEG-PLL與DNA形成了聚離子復合物膠束;DNA與PLL通過(guò)靜電作用形成核,PEC包裹在其外面得到的聚離子復合物膠束為均相體系即使在化學(xué)計量點(diǎn)也不會(huì )沉淀,保持著(zhù)很好的流動(dòng)性和穩定性這--點(diǎn)對基因治療是很重要的而且隨著(zhù)PLL段的增加,包覆效果更好聚離子復合物膠束使得DNA具有較強的核酶抗性;大小在10~35nm之間呈球形聚離子復合物膠束能夠用于基因的傳遞使基因在昆蟲(chóng)細胞系SF9中能夠表達出蛋白質(zhì).關(guān)鍵詞聚賴(lài)氨酸聚乙二醇嵌段共聚物;DNA聚離子復合物膠束中圖分類(lèi)號:0647.2文獻標志碼:A隨著(zhù)人類(lèi)基因圖譜的繪制完成在不久的將來(lái)人類(lèi)的所有疾病都有可能通過(guò)基因進(jìn)行治療.然而,其中一個(gè)主要的問(wèn)題就是基因載體的開(kāi)發(fā),目前,用于基因治療的載體主要是病毒病毒雖然具有轉染效率高的特點(diǎn)但是它存在-個(gè)致命的弱點(diǎn)那就是與人體的相容性不好會(huì )產(chǎn)生免疫原性存在嚴重的安全問(wèn)題1].與病毒載體相比非病毒載體具有無(wú)傳染性、不限制載體容量.可大量制備等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越受到研究人員和臨床醫生的關(guān)注.因此非病毒基因載體的研究成為當前的一個(gè)研究熱點(diǎn).目前非病毒基因載體主要是聚陽(yáng)離子[2-8]存在在化學(xué)計量點(diǎn)時(shí)易沉淀的問(wèn)題不能保證足夠的流動(dòng)性聚陽(yáng)離子過(guò)量又會(huì )產(chǎn)生毒副作用.本文中利用聚賴(lài)氨酸與聚乙二醇的三嵌段共聚物與DNA結合,由于形成的復合物的外面包裹PEG ,即使在化學(xué)計量點(diǎn)時(shí)也不會(huì )產(chǎn)生沉淀.1實(shí)驗部分1.1主要試劑PLI(Z)-PEG-PLI(Z按文獻9]合成.胰蛋白酶Trypsin):E0C0311武漢亞法生物技術(shù)公司;Dnase [ Deoxyribonuclease I ) :Code D2210 ,TaKaRa 33 %溴化氫乙酸溶液,ACROS Co.質(zhì)粒DNA :FGgH- FGgH(5.5 kb )按文獻10抽提.1.2 主要儀器紅外光譜用Perkin - Elmer Spectrum one型紅外光譜分析儀(美國) ,KBr壓片. 'HNMR測試采用美國Varian公司INOVA-600型核磁共振光譜儀,以重水為溶劑.熒光光譜采用ShimadzuDATARecorderDR-3型熒光光譜儀激發(fā)波長(cháng)為527nm發(fā)射波長(cháng)為585nm.紫外光譜采用PekinEImerλ-17型紫外可見(jiàn)光譜儀.測量波長(cháng)為260nm時(shí)對應的OD值.TEM測試采用H-7000FA(HTTACH)型透射電子顯微鏡TEM )加速電壓為80kV .制樣時(shí)先在銅網(wǎng)上敷-層富爾膜再在膜上噴涂碳膜輕輕滴一滴樣品溶液迅速吸干真空干燥后進(jìn)行TEM測試原子力顯微鏡將一點(diǎn)樣品輕輕滴加到玻璃上,自然風(fēng)干然后在NS3a型原子顯微鏡下觀(guān)察.凝膠成像系統:U中國煤化工.激光共聚焦顯微鏡:LEICA公司TCS SP2型.TYCNMHG收稿日期2004-06- 12.基金項目湖北省高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗室基金作者簡(jiǎn)介楊子剛1977- )男 碩士程時(shí)遠通訊聯(lián)系人E - mail scheng@ publie . wh. hb. cn第4期楊子剛等聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸與DNA聚離子復合物膠束的研究3231.3實(shí)驗步驟1.3.1 聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸PLL- PEG- PLL )的合成 向一 定量的聚( Ne -芐氧羰基賴(lài)氨酸)-聚乙二醇-聚(Ne-芐氧羰基賴(lài)氨酸)中加入33%的溴化氫的乙酸溶液,10min后變?yōu)橥该鞯娜芤豪^續反應又慢慢變渾濁50 min后停止反應.將反應液倒入-定量的無(wú)水乙醇中沉淀,過(guò)濾再用無(wú)水甲醇溶解再用無(wú)水乙醇沉淀過(guò)濾真空室溫抽干.1.3.2 聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸與DNA聚離子復合物膠束的制備 聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸和DNA分別用pH7.4的Tris - HCl緩沖溶液配制成一定濃度的溶液 聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸所帶正電荷按照其中賴(lài)氨酸的聚合度與物質(zhì)的量的乘積計算,DNA所帶的負電荷由其中堿基的個(gè)數與DNA物質(zhì)的量的乘積計算,因為堿基與DNA分子中提供負電荷的磷酸基團的數目是-致的.然后配制成-系列不同電荷比的復合物在所有的實(shí)驗中DNA的最終濃度都控制為15mg/L.用于聚離子復合物大小和形態(tài)的研究.1.3.3 聚離子復合物膠束的熒光分析 將溴化乙錠按照EB: DNA的質(zhì)量比1:5加入到聚離子復合物膠束中避光放置12 h然后用熒光光譜儀進(jìn)行測試.1.3.4 聚離子復合物膠束對脫氧核糖核酸酶I的抗性按下列配方進(jìn)行酶切實(shí)驗:脫氧核糖核酸酶Ibuffer2μuL聚離子復合物膠束10山脫氧核糖核酸酶0.2山用雙蒸水加到總體積為20山25°C酶切80min后80 C水浴加熱使脫氧核糖核酸酶失活然后加入40μL1 %的胰蛋白酶瞬時(shí)離心后置于37 C水浴中30 min再加入60 puL異戊醇/氯仿1:24 V/V )溶液.12000 r/min離心5 min取上層液加入3pμL3mol/L乙酸鈉溶液,100μxL無(wú)水乙醇AC放置40min.12000r/min離心10min去掉液體,37C恒溫烘干再加入20p山Tris-HCl溶液電泳觀(guān)察用凝膠成像系統拍照.1.3.5轉染實(shí)驗使用無(wú)抗生素的培養基培養細胞待細胞密度達到90%~95%在100puL無(wú)血清的SFM培養基中加入10yuL的DNA形成SolutionA另100pμ無(wú)血清的SFM培養基中加入100pμ的嵌段共聚物形成Solution B分別輕輕混勻將溶液A和B混合后.27 °C溫育30~45 min然后補加800 pu山的SFM將上述1mL混合液加入到細胞培養平板(己用2mL無(wú)血清培養基洗過(guò)一次)中使分布均勻27C培養4~6h后吸去以上加入的1 mL混合液再加入3 mL完全培養基(含血清)培養72 h后用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察.2結果與討論2.1聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-賴(lài)氨酸的制備聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸按schemel步驟由聚(N∈-芐氧羰基賴(lài)氨酸)-聚乙二醇-聚( N-芐氧羰基賴(lài)氨酸)氨基去保護生成,去保護是在33 %的溴化氫的乙酸溶液中進(jìn)行的同時(shí)反應條件要求無(wú)水無(wú)氧.從紅外光譜圖,1 705 cm-l處沒(méi)有羰基的特征吸收峰,從而證明芐氧羰基的去除.圖1是聚合物的'HNMR化學(xué)位移的歸屬為3.62 - CH2-CH2-0- ),3.08( δ-CH2 ),1.62~1.71( (CH2)- )未見(jiàn)有苯環(huán)上質(zhì)子的化學(xué)位移，從而可以確定芐氧羰基已經(jīng)完全除去.另外有3.62 - CH- -CH2-o- )3.08( δ- - CH2 )對 應的積分值計算出聚合物的組成結果聚合度沒(méi)有變化,由此可見(jiàn)在去保護過(guò)程中不會(huì )發(fā)生聚合物鏈的斷裂.H( NHCHOC )，NHCH2CH( 0CH2CH2 )mOCH2CH2NH( COCHNH ),HR33 % HBCHgCOOHH( NHCHOC ) NHCH2CH( 0CH2CH2 )0CHLCHNH_ COCHNH ),H中國煤化工MHCNMHGR =( CH2 2NHC00CH2-R2 =( CH2 )NH2Schemel聚賴(lài)氨酸 -聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸的合成路線(xiàn)324湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第26卷2.2嵌段共聚物膠束介 導基因傳遞的一般過(guò)程在生理條件下,DNA是帶負電荷的柔性大分子沒(méi)有外力或載體的作用是很難穿過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞的當嵌段共聚物的陽(yáng)離子部分與帶負電的DNA分子形成聚離子復合物膠束( polyion complex micelle )后其尺寸明顯減小可以通過(guò)細胞內吞或吞噬作用進(jìn)入細胞在細胞內緊密的復合物可以保護DNA避免核酸酶的降解.圖2是聚離子復合物膠束介導的基因傳遞的一般過(guò)程.在DNA進(jìn)入細胞之前,DNA與嵌段共聚物首先復合形成緊密的聚離子復合物膠束聚離子復合物膠束通過(guò)胞吞途徑進(jìn)入細胞質(zhì)在其中會(huì )與內體、溶酶體結合，通常情況下內體和溶酶體的pH值( pH值為5.5 )和酶-般會(huì )導致進(jìn)入其中的DNA的降解但是pH5~ 7范圍內具有較高緩沖能力的聚陽(yáng)離子能夠與內體中質(zhì)子結合導致內體的滲透壓升高,內體的膜更容易破裂聚離子復合物膠束會(huì )從內體逃逸.聚離子復合物膠束從內體中逃逸進(jìn)入細胞質(zhì)在細胞質(zhì)中擴散到細胞核的模上然后進(jìn)入細胞核在那里DNA轉錄成RNA后翻譯成蛋白質(zhì)行使功能.2.3 DNA 濃度的測定先將抽提 出的質(zhì)粒DNA用Tris - HCI緩沖溶液稀釋再用紫外分光光度計測出波長(cháng)為260 nm時(shí)的吸收值然后按照1 0D260 = 50 mg/L雙鏈DNA的比例計算出DNA的濃度.2.4聚賴(lài)氨酸- 聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸對DNA的包覆本文討論 了聚合物1( PLL20- PEG - PLL20 )和聚合物2X PL12 - PEG- PLL12 )對質(zhì)粒DNA FGgH - FGgH的包覆能力包覆結果通過(guò)溴乙錠( ethidium bromide ,EB )的熒光強度來(lái)檢測.不圖3是同電荷配比的聚合物/DNA/EB體系的熒光光譜圖縱坐標為相對于DNA/EB體系的熒光強度橫坐標為電荷比.當向DNA/EB體系中逐漸加入聚合物時(shí)隨著(zhù)電荷比的增加熒光強度先急劇減小然后達到一恒定值.這3.5 2.5~ 15是因為EB是一種陽(yáng)離子熒光染料能夠強烈而又特異性地與雙螺旋的DNA相互作用當EB分子的菲啶環(huán)插入到DNA54的雙螺旋堿基對之間阻止了溶液中水分子通過(guò)質(zhì)子轉移而圖1 PLL- PEG - PLL的核磁共振譜使激發(fā)態(tài)EB分子的能量損失，從而EB的熒光強度很大.當向體系中逐漸加入聚合物時(shí),帶正電荷的聚合物與DNA結UptakeEndoeytosis合將EB置換出來(lái). 然而,在Tris- HCI緩沖溶液中激發(fā)態(tài)的EB經(jīng)過(guò)-個(gè)非輻射衰減過(guò)程這時(shí)激發(fā)態(tài)EB的一個(gè)氨基E'scape質(zhì)子被轉移給溶劑，從而導致其熒光強度下降.; Endoneoine以上實(shí)驗結果說(shuō)明了聚合物能夠包覆DNA形成聚離子Disociation復合物膠束:DNA 與PLL通過(guò)靜電作用形成核PEG包裹在Nuclear Entry其外面外觀(guān)上聚離子復合物膠束為均相體系即使在化學(xué)計量點(diǎn)也不會(huì )沉淀保持著(zhù)很好的流動(dòng)性和穩定性.同時(shí)比較圖圖2基因傳遞示意圖3中的2條曲線(xiàn),可以看出對于聚合物1 ,達到熒光值穩定的電荷比趣100為1.1;對于聚合物28C照8(則為1.3 ,這是由于部60分正電荷包裹在里面不健40能有效的與DNA結合中國煤化工的緣故.從曲線(xiàn)還可以愁20MYHCNMHG看出:隨著(zhù)PLL段的增0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.0 0.51.01.52.0253.0加即陽(yáng)離子段的增加，聚合物1與DNA的電荷值聚合物2勺DNA的電荷值對DNA的包覆效果要圖3電荷比對 EB熒光強度的影響好一些.第4期楊子剛等聚賴(lài)氨酸-聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸與DNA聚離子復合物膠束的研究3252.5聚離子復 合物膠束對核酶的抗性圖4是電泳后用凝膠成像拍攝的照片，從左到右第1道為聚合物2與DNA復合物.經(jīng)核酶處理后的電泳帶第2道為聚合物1與DNA復合物經(jīng)核酶處理后電泳帶;DNA經(jīng)核酶處理后的情況如第3道第4道為沒(méi)有用核酶處理的DNA;第5和第6道分別是化學(xué)計量比時(shí)聚合物1/DNA和聚合物2/DNA未經(jīng)核酶處理的情況.從圖可以看出用聚合物包覆的DNA經(jīng)核酶處理后帶的強度與純DNA基本相同,說(shuō)明DNA的濃度基本沒(méi)變聚離子復合物膠束對核酶有很好的抗性(帶1、2) ,而沒(méi)有用聚合物包覆的DNA則完全降圖4 DNA 的電泳圖.解了(帶3).化學(xué)計量比的聚離子復合物因為靜電荷為零在電泳條件下不會(huì )發(fā)生移動(dòng),另外由于其中的DNA被聚合物包覆,EB不能插入DNA的堿基對之間,因此電泳時(shí)不會(huì )顯示出DNA對應的電泳帶.2.6 聚離子復合物膠束形態(tài)、大小圖5是聚合物1與DNA形成的聚離子復合物膠束的原子力顯微鏡圖片從圖可以看出:聚離子復合物膠束呈球形其大小為10~ 35 nm.圖6是同一聚離子復合物膠束未經(jīng)染色的透射電鏡的照片,圖7是經(jīng)過(guò)圖5聚離子 復合物膠束的AFM2.0 %的乙酸鈾染色的電鏡照片,從上述兩圖可以看出聚離子復合物膠束主要呈球形其中有少量的橢球形大小也在10~ 35 mm之間與原子力圖片一致;另外圖7中球形離子的核部分要比外圍部分顏色較深這是因為乙酸鈾是DNA的染色劑,而對聚合物不染色,DNA經(jīng)乙酸鈾染色后顏色加深所以出現上述情況.同時(shí)可以證明DNA是被聚合物包裹在里面的.形成的聚離子復合物大小很好地滿(mǎn)足了用于基因治療的載體在人體中流動(dòng)的需要11].圖6聚離子 復合物膠束的TEM圖7聚離子復合物膠束的TEM圖8轉染后的激光共聚焦顯微鏡圖片( x50000未染色)( x 100000 2.0 %乙酸油染色pH4.5)2.7轉染實(shí)驗圖8是聚合物1與DNA形成的聚離子復合物膠束轉染昆蟲(chóng)細胞系SF9后用激光共聚焦顯微鏡拍攝到的圖像.從圖中可以看出:聚離子復合物膠束能夠介導DNA的傳遞并且使DNA在生物體中表達出相應的蛋白質(zhì)圖中出現綠色這與我們使用的DNA有關(guān)因為我們使用的DNA中含有綠色熒光蛋白(GFP)基因,它表達出蛋白質(zhì)具有熒光效應YH中國煤化工現綠1色.因而說(shuō)明DNA能夠在生物體中表達生成相應的蛋白質(zhì).同時(shí)證明形成CNMHGA的活性沒(méi)有影響其中的DNA是具有生物活性的.3結論PLL- PEG- PLL與DNA形成的聚離子復合物膠束滿(mǎn)足了基因傳遞的基本條件聚離子復合物膠束326湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第26卷使得DNA具有較強的核酶抗性，大小在10~ 35 nm之間呈球形聚離子復合物膠束能夠用于基因的傳遞使基因在昆蟲(chóng)細胞系SF9中能夠表達出蛋白質(zhì).參考文獻:[ 1 ]Maureen D B Andreas G s , ljeoma F U. 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School of Chemistry and Material Science , Hubei University , Wuhan 430062 China ;2. School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 China)Abstract PLL - PEG - PLL were obtained by deprotetion of amino of PLI( z)- PEG- PLI( z). The proper-ties of polyion complex micelle ( PIC ) which consists of PLL- PEG- PLL and DNA were investigated. It showed :PLL- PEG- PLL could condense DNA , larger PLL were generally more effective at condensation ; the system is ho-mogenous and can not precipitate even under charge - neurtralized condition. Remarkable increase in the nucleaseresistance of DNA through the incorporation into the core of PIC ;PIC were spherical , the size were 10~ 35 nm. PICcan apply to gene delivery and the DNA can express in the cell line SF9 .Key words :poly( L - lysine ) ipoly( ethylene glycol ) ;block copolymer ; DNA ; polyion complex miell( PIC )(責任編輯游俊)中國煤化工MHCNMHG