多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法

2003 年第23卷有機化學(xué)Vol. 23. 2003第11期，1320- 1323Chinese Jounal of Organice ChernisiryNo. 11. 1320- 13.學(xué)術(shù)動(dòng)態(tài).多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法王良友” 劉克良(軍事醫學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所北京100850)摘要聚乙二醇是一類(lèi)具有獨特理化性 質(zhì)的大分子聚合物多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物經(jīng)聚乙二醇共價(jià)修飾后能明顯改善其藥代學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，,如降低免疫原性、增加對蛋白水解酶的穩定性.增加水溶性及延長(cháng)體內的半衰期等.蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究已取得較好的效果.多肽的聚乙二醇化修飾研究起步較晚.對近年來(lái)多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法進(jìn)行了綜述.主要介紹了對多肽和蛋白質(zhì)的N端.C端及某些氨基酸側鏈進(jìn)行選擇性聚乙二醇化修飾的方法.關(guān)鍵詞聚乙二醇, 聚乙二醇化修飾,多肽,蛋白質(zhì)Methods of Peptide and Protein PegylationWANG, Liang You"LIU, Ke-Liang( lstiute of Phamacologo and Toriology, Academy of Miliany Melical Scienes ，Beying 100850)Abstract With typical molecular weights of 500 ~ 20000, polyethylene glycol (PEC) is nontoxic, nonimmunogenicand soluble in aqueous solutions as well as in most organic solvents. The covalent atchment of PEC ( pegylation) topeptides and proteins can significantly improve their pharmacological and biological properties, such as shieldingimmunogenic epitopes, preventing degradation by proteolytic enzymes, increasing solubilty, reducing renal fltrationand altering biodistribution. Some methods in this field especially on site-directed pegylation for amino, carboxyl andthiol groups of peptides and proteins are reviewed.Keywords polyethylene glycol, pegylation, peptide, protein聚乙二醇(palyethylene glycol, PEG)是一類(lèi)具有獨特理化步的研究表明.蛋白質(zhì)經(jīng)聚乙二醇化修飾后還可以改善許多性質(zhì)的大分子聚合物.它具有良好的水溶性,也能溶于二氯其它方面的性質(zhì),如增加蛋白質(zhì)對酶的穩定性、延長(cháng)蛋白質(zhì)甲烷、N":N"-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有機溶劑.聚乙在血漿中的半衰期、增加在水中的溶解度等|1-~3l.-.些蛋白二醇由環(huán)氧乙烷聚合而成,通過(guò)控制反應條件可得到平均分質(zhì)的聚乙二醇化修飾物在作為藥物的應用中取得了較好的子量由幾百到幾萬(wàn)的聚合物.普通的聚乙二醇分子兩端各有效果.1991年,第一種經(jīng)聚乙二醇化修飾的蛋白質(zhì)類(lèi)藥物一個(gè)羥基,若一端以甲基封閉則得到單甲氧基聚乙二醇PEG腺苷脫氨酶被FDA批準.上市'4 ,用于治療- .種嚴重的(mononethoyolyethylene eyco, mPEG). 在多肽和蛋白質(zhì)的兒童免疫缺陷癥. 2001年,用聚乙二醇修飾的干擾素(PEC-聚乙二醇化修飾(eglain)研究中應用最多的是mPEG的INTRON)經(jīng)FDA批準上市15.),用于治療慢性丙型肝炎.多衍生物.肽與蛋白質(zhì)在理化性質(zhì)上具有許多相似之處.肽類(lèi)化合物的聚乙二醇化修飾研究晚于蛋白質(zhì)的相關(guān)研究,近年來(lái)關(guān)于肽PEG: HO -(CH2CH20)n- -CH2CH2-0H類(lèi)化合物的聚乙二醇化修飾研究也取得了一些進(jìn)展.尤其是mPEG: CH2O -(CH2CH20)。- - CH2CH2- -OH肽類(lèi)化合物在聚乙二醇化定點(diǎn)修飾方面較蛋白類(lèi)物質(zhì)更易于實(shí)現，因此開(kāi)展肽類(lèi)化合物的聚乙二醇化修飾研究也具有蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾研究始于二十世紀七十年代，較重要的意義.最初的目的主要是為了降低蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的免疫原性.進(jìn)-一在多肽的聚乙二醇化修飾研究中應用最普遍的是中國煤化工E-mail: liangwang@ 163. net; Te!: 01066932302; Fax: 010-68211656.Received Febnuary 26. 2003; resed June 1l, 200; acopted August 7, 200.MHCNMHGNo.11王良友等:多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法1321mPEC,先在mPEG的末端引人羧基、氨基或其它活性基團，或者制備經(jīng)mPEC修飾的氨基酸衍生物，再利用固相或液NK相法將其偶聯(lián)到肽序列中去.實(shí)現對多肽的N端,C端及某些氨基酸側鏈的聚乙二醇化修飾.下面主要介紹近年來(lái)文獻mPEG-0H + Ts-ClEgN. mPEG-OTs .報道關(guān)于多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化定點(diǎn)修飾的- -些方法.1多肽和蛋 白質(zhì)中氨基的聚乙二醇化修飾方法H2N-NH:H2OmPEG- -NmPEG-NH2在多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法中，主要是對NmPEG-NHCOCH2CH2COOH末端或賴(lài)氨酸側鏈氨基進(jìn)行?；揎椧驗榈鞍捉Y構中通常存在多個(gè)氨基,所以控制和確定修飾位點(diǎn)及修飾程度-直是Scheme 1蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中的一個(gè)難點(diǎn).肽類(lèi)化臺物的合成中可以通過(guò)采用適當的保護策略來(lái)實(shí)現對氨基的定點(diǎn)修飾.Lee等[9]以平均分子量為5000 的單甲氧基聚乙二醇甲1.1 N端氨基的?；揎楑ｇ牾啺?SC-mPEG)在弱堿性水溶液中(pH= 8)修飾鮭為了實(shí)現對肽鏈中氨基的聚乙二醇化?；揎?需要在降鈣素(sCT),經(jīng)RP-HPLC分離得到N端1y"和Iys"側鏈聚乙二醇上首先引入羧基或活化的羰基.1993年,Lu等[1]首氨基分別被聚乙二醇?；揎椀娜N產(chǎn)物,產(chǎn)物結構經(jīng)酶解先報道了在固相多肽合成中應用單甲氧基聚乙二醇的羧基和質(zhì)譜分析得到確證,它們在大鼠腎臟勻漿中的半衰期分別術(shù)生物對肽鏈的N端氨基進(jìn)行?；揎椀姆椒?以mPEG作為125.5, 157.3和281.s min,比sCT在大鼠腎臟勻漿中的半原料,先合成mPEG- -OCH2CO0H 和mPEC-0CH2CO- -Nle-衰期(4.8 min)顯著(zhù)增加.用相同的方法,Lee等[10以平均分OH,在mPEG中引入一個(gè)正亮氨酸(Nle)作為標記是為了便子量為3400的SC-mPEC對表皮生長(cháng)因子(EGF)進(jìn)行修飾，于確定每一-個(gè)多肽分子上偶聯(lián)了幾個(gè)mPEC分子.應用Fmoc經(jīng)RP-HPLC分離到N端、Ly38和Lys8S側鏈氨基分別被聚乙固相多肽合成法,先在樹(shù)脂上合成全保護肽鏈，當游離出N二醇?；揎椀娜N產(chǎn)物.生物活性測定表明,N端修飾產(chǎn)末端氨基后,以BOP作縮合劑,將mPEG--0CH.CO- -Nle-物活性高于Ly?"和Lys側鏈修飾產(chǎn)物.OH作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈上,然后經(jīng)三氟乙酸裂解和反SC-mnPEG及其類(lèi)似物在蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中應相高效液相色譜(RP.HPLC)純化得到了平均分子量分別為用較多,反應條件容易實(shí)現,一般在弱堿性的水溶液中進(jìn)行.2000和5000的mPEG修飾N.端的4肽.8肽和12肽,mPEG控制蛋白質(zhì)和SC-mPEG的比例可以得到單聚乙二醇化修飾修飾產(chǎn)物在RP-HPLC分析圖譜上呈單一峰,結構經(jīng)MALDT-的產(chǎn)物產(chǎn)物的純化方法也比較簡(jiǎn)便,可用透析電泳及凝膠TOF-MS分析得到確證研究還表明，聚乙二醇對三氟乙酸處色譜等常用方法實(shí)現.由于SC-mPEC對游離氨基沒(méi)有選擇理穩定,但氟化氫處理時(shí)會(huì )有部分斷裂,故此法不適用于性,當有多個(gè)氨基時(shí),往往難以實(shí)現定點(diǎn)的聚乙二醇化修飾，Boc固相多肽合成法(Eq.1).分析和確定產(chǎn)物中聚乙二醇的修飾位點(diǎn)也較難(Eq. 2).mPEG-OH + BrCH2C0OCH2CH3BuLiSC-mPEG: mPEG- -0-mPEG-0OCH2C0OCH2CH3(1) NaOH_- mPEG- -OCH2C0OH (1)(2)HCT0雖然mPEC- -OH 與琥珀酸酐反應可以很容易地得到mPEG-- -0COCH2CH2C00H,但此分子中含有對酸和堿都不太mPEG-0-+ H2N-PeptidepH=g.穩定的酯鍵,,不適合用于固相多肽合成中.若通過(guò)mPEG-NH2與琥珀酸酐反應引人羧基得到mPEG- -NHCO-CH2CH2COOH,此類(lèi)分子具有較好的穩定性,適用于固相多mPEG-0-C-HN-Peptide(2)肽合成中.mPEC--NH2可通過(guò)購買(mǎi)商品化試劑獲得,也可以由mPEG- - OH作原料合成[8].在mPEC- -0CH2COOH 的合成1.2 賴(lài)氨酸鍘鏈氨基的?；揎椫袘昧硕』?反應需在絕對無(wú)水條件下進(jìn)行,而Lu等*川]報道以mPEC羧基衍生物修飾賴(lài)氨酸側鏈氨基mPEG- -NHC0CH2CH2C0OH的合成比較容易些(Scheme 1).中國煤化工MYHCNMHG1322有機化學(xué)Val. 23. 2003得到Fmoc-Lys( mPFG- -0CH2CO)- -OH, 在固相多肽合成中將mPEG- -NH2 + Fmoc-Asp- -Bu-BOP其作為一個(gè)單體偶聯(lián)到肽鏈中去，實(shí)現聚乙. _醇對肽鏈中特定賴(lài)氨酸側鏈氨基的聚4二醇化修飾.也可以在固相合成過(guò)mosaP(mPFG- -NH)-OBu+ TFA。中用烯丙氧羰基(Aloc)保護特定位置的賴(lài)氨酸側鏈氨基.肽FmoC-Asp(mPEG- -NH)-OH鏈組裝完畢后先脫除Alloe,再將mPEG- 0CH2C00H 偶聯(lián)到Scheme 3賴(lài)氨酸側鏈氨基上去.然后經(jīng)三氟乙酸裂解、RP-HPIC純化可得到對肽鏈中特定賴(lài)氨酸側鏈氨基進(jìn)行聚4二醇化修飾3多肽和蛋白質(zhì)中巰基的聚乙二醇化修飾方法的產(chǎn)物.此法適用于Fmxe固相多肽合成法中對賴(lài)氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme 2).Campbell等[3]在生長(cháng)激素釋放因子(GRF)類(lèi)似物的C端引人半胱氨酸,在mPEG上引人巰基吡啶,然后通過(guò).二硫鍵交換實(shí)現mPEG對CRF類(lèi)似物C端的修飾(Eq.4).HOSu: HO-NPepide- -SI+ mPEG-S-p=4mPEG-OCH2COOH .HOSu/ DCCmPFG-OCH2COOSuPeptide--S-S- mPEG(4Fmoc-Lys- -OHFmoc-Lys (mPEG-0CH2CO)- -0HVanetswinkel 等141用定點(diǎn)突變法在蛋白質(zhì)中引人半胱氨酸,以mPEG MAL作為聚乙二醇化試劑，通過(guò)蛋白質(zhì)上的Scheme 2巰基加成到mPEC-MAL的雙鍵上實(shí)現對蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾，此法已在許多蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾中取得了良好的效1.3 N端氨基的烷基化修飾.果15.161 .mPEC-MAL可通過(guò)商品化試劑買(mǎi)到,也可以用Kinstler等12用聚乙二醇的醛基衍生物(mPEG--CH0)mPEC- -NH2為原料合成[17].若在肽鏈中引入半胱氨酸,也可修飾rhG-CSF.反應在pH為5.0的水溶液中進(jìn)行.活潑的醛以實(shí)現此類(lèi)反應(Schene 4).基可將聚乙二醇偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子的氨基上,同時(shí)以氰基硼氫化鈉作為還原劑實(shí)現穩定的烷基化修飾.此法具有較好的選擇性,主要是修飾蛋白質(zhì)的N末端氨基.其溫和的反應條mPEG-MAL: CH20- (CH2CH20)= -CH2CH2 -N件適用于固相或液相多肽合成.此法若應用于多肽的N端.氨基修飾可能也會(huì )取得較好的效果(Eq.3).NaCNBH3ymPEG-C-H+ H2N-Protein(1) Maleic anhydridemPEG- -NH2(2)ACQONaOH mP:C-YmPEG- CH2- -HN- -Procin3)02多 肽鏈中羧基的聚乙二醇化修飾方法pH= 7-8mPEG-B + HS-PepideLu等!川以mPEC--NH2作原料修飾天冬氨酸側鏈羧基得到Fmoc- Asp(mPEC- NH)一 OH,將其用到固相多肽合成中-S-Pepide實(shí)現聚乙二醇對肽鏈中天冬氨酸側鏈羧基的修飾.也可以在mPEG一1合成過(guò)程中用烯丙基(Al]yl)保護特定位置的天冬氨酸側鏈羧基,肽鏈組裝完畢后在固相上先脫除Allyl,再將mPEC-NH2偶聯(lián)到天冬氨酸側鏈羧基上,實(shí)現對肽鏈中特定天冬氨Scheme 4酸側鏈發(fā)基的聚乙二醇修飾.此法適用于Fmoe固相多肽合成法中對天冬氨酸或谷氨酸的定點(diǎn)聚乙二醇化修飾(Scheme4其它方法在固相多肽合成中,若先將Fmoc-NH- -PEG -C00H偶近年來(lái),蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法發(fā)展很快,為多.聯(lián)到樹(shù)脂上，再合成肽鏈.最后用三氟乙酸裂解,可以實(shí)現肽肽的聚中國煤化工年。Wylie等8通過(guò)控鏈C末端羧基的聚乙二醇化修飾.制pH值CNMHG1質(zhì)中的組氨酸側鏈No.11王良友等:多肽和蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾方法1323的瞇唑基. Satd191 用谷氨酰胺轉氨酶( transglutaminase,Ishi. A.; Ueno, T. Prog. Polbm. Si. 1998, 23. 1233.TCGase)將mPFG-NH2轉移到蛋白質(zhì)的谷氨酰胺側鏈上,實(shí)現Inada, Y.; Funukawa, M.; Sasaki, H.; Kodera. Y; Iliroto ,M; Nishimua, H.; Matsushina, A. Trends Bioterhnol. 1995,對谷氨酰胺的選擇性修飾.借鑒這些方法.也有可能實(shí)現對肽鏈中組氨酸和谷氨酰胺側鏈的選擇性聚乙二醇化修飾13, 86.Kozloski, A.; Harris. J. M. J. Cortrouled Relese 2001. 72.(Eq. 5).217.6 Wang, Y. S.; Youngster, s; Crace, M; Bausch, J;mPFG-NH2 + R- -CONH2 Luas mPEG- -NHOC- -R (5) .Bordens, R.; Wyss, D. F. Adu. Drug Deliuery Rer. 2002, S4.547.lu, Y. A.; Felix, A. M. Pept. Res. 1993, 6. 140.5結束語(yǔ)8 Haris, J. M.; Struck, E. C.; (Case, M. C.: Paley. M. s. J.Poly. Sci.. Poly. Chem. Ed. 1984, 22, 341.隨著(zhù)蛋白質(zhì)的聚乙二醇化修飾技術(shù)的迅速發(fā)展,肽類(lèi)化9 Lee, K. C.; Morm. s. C.; Park, M.0.; Lee, J T: Na.合物的聚乙二醇化修飾研究越來(lái)越引人注目20).蛋白質(zhì)的D. H.; Yoo, s. D.; lee, H. s.; DelLucd, P. P. Pharm.聚乙二醇化修飾幾乎都在水溶液中進(jìn)行,通過(guò)選擇合適的聚Res. 99，16, 813.乙二醇化試劑或控制反應條件來(lái)實(shí)現定點(diǎn)、定量修飾.肽類(lèi)10 Lee, H; Park, T. G. Pharm. Res. 2002, 19, 845.化合物的聚乙二醇化修飾可在固相載體上進(jìn)行,此法易于實(shí)11 Lu.Y. A.; Feix, A. M. Imt. J. Pept. Prolein Res. 194.現對多肽鏈中某位點(diǎn)的選擇性修飾,但固相合成反應速度43.127.慢,且隨著(zhù)聚乙二醇或多肽分子最增加，修飾難度增大;肽類(lèi)12 Kinsler, 0. B.; Brems, D. N,; lauren, s. T; Paige, A. (.:Hamburger, J. B.; Treubeit, M. J. Pham. Res. 1996， I3,化合物的聚乙二醇化修飾也可以在水溶液中進(jìn)行,可以實(shí)現分子量較大的聚乙二醇對分子量較大的多肽的修飾,但若有996.多個(gè)反應位點(diǎn)時(shí)產(chǎn)物分離及修飾位點(diǎn)的確定都有較大的難I3 Campbell, R. M; Heimer, E. P.; Ahmad, M.: Eiseubeis. H.G.; Lambros. T. J; Lee, Y.; Miller, R. w; Stnicker. P.度.多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)化合物經(jīng)聚乙二醇化修飾后具有降低免R.; Felixs, A. M.1. Pept. Res. 1997. 49, 527.疫原性增加水溶性、顯薯延長(cháng)其在生物體內的半衰期等優(yōu)14 Varwetsewinkel, S.; Plaisance, S.; Zhang， Z.; Valinthour,點(diǎn),但也可能因修飾而影響其與受體的結合,因此尋找合適1; Brepoels, K.; Lasters, 1; Collen, D.: Jespers, 1.. Blood的修飾位點(diǎn),保持持續、有效的生物活性是多肽和蛋白質(zhì)的2000, 95. 936.聚乙二醇化修飾研究的主要目的.多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的聚15 Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/ Technologsy 1990. 8, 343.乙二醇化修飾研究有較好的應用前景.16 He, X. H.; Shaw, P. C.; Tam, S. C. lifeSri. 1999, 65.355.References17 Kogan, T. Symth. Commun. 1992, 22 , 2417.18 Wylie, D. C.; Voloch, M.; Lee, S.; liu, Y. H; Cannon-Zalipsky, s. Adu. Drug Delivery Rer.1995, 16, l57.Carlson, S.; Cutler, C.; Pramanik. B. Pharm. Res. 2001,? Roberts, M. J.; Bentley, M. D.; Haris, J. M. Adur. Dnug .I8, 1354.Delinery Rev. 2002, 54, 459.19 Salo, H. Adu. Drug Delinery Rev, 2002, 54, 487.3 Kodera, Y.; Matsushima, A.; Hiroto, M. ; Nishimura. H;20 Veronese, F. M. Biomaterials 2001, 22, 405.(Y0302262 QIN. x. Q.; UING, J.)中國煤化工MYHCNMHG