聚乙二醇一步沉淀提取卵黃抗體

第29卷第5期福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol. 29 No.5_2001 年10月Jourmal o[ Fuzhou University( Natural Science)Oct.2001文章編號:1000- 2243(2001)05 - 0123 -04聚乙二醇一步沉淀提取卵黃抗體王輝龍，周建武，王中來(lái),饒平凡.(福州大學(xué)生物工程研究所,福建楣州350002)摘要:利用聚乙二醉一步沉淀法提取卵黃抗體.當聚乙二醇濃度為5%時(shí)，可獲得66%抗體回收率,抗體純度達92%;當聚乙二醇濃度為10%時(shí)，抗體純度為85%，但可獲得99%的抗體回收率，且抗體活性沒(méi)有損失.關(guān)鍵詞:卵黃抗體;聚乙二醇;沉淀;提取中圖分類(lèi)號: TQ936.2文獻標識碼: A經(jīng)抗原免疫的母雞能將體內的抗體傳遞到雞蛋的卵黃中，從卵黃中提取的抗體稱(chēng)為卵黃抗體(IgY).IgY與哺乳類(lèi)動(dòng)物血清中分離的抗體相比具有許多突出的優(yōu)點(diǎn).如來(lái)源廣、費用低、作為免疫檢測試劑時(shí)，不會(huì )激活補體1、不會(huì )與類(lèi)風(fēng)濕因子結合[2]等.近年來(lái)，在卵黃抗體的純化方面已進(jìn)行了大量的研究[3-8),通常是在制備水溶性蛋白組分后,采用多次沉淀初步分離抗體,再應用各種色譜進(jìn)行純化.這些方法在獲得IgY純度和活性方面有其優(yōu)點(diǎn),但是包括了很多耗費時(shí)間的步驟，如多次鹽析,乙醇沉淀，凝膠過(guò)濾，色譜和滲析等,不易規?；a(chǎn)，本文報道了-種簡(jiǎn)單的提取卵黃抗體的方法.在制備水溶性蛋白組分后，用低濃度聚乙二醇(PEG)一步沉淀提取卵黃抗體,在不經(jīng)色譜分離的情況下取得滿(mǎn)意的純度和活性.1材料與方法1.1 試劑與材料嗜水氣單胞菌株(福建省農科院生物中心); PEG(分子量為6000,華美生物工程公司);堿性磷酸酶標記的抗IgY二抗(兔抗雞二抗, Sigma); 磷酸對硝基苯酯二鈉(0364 - 5G, AMRESCO); 翅濾膜(SMB -20型，中科院上海原子核研究中心); TSK G3000SW(TOSOH corporation).1.2抗原的制備保存的嘈水氣單胞菌株經(jīng)活化后接入普通培養基，在37C下培養48h,離心(10 000 r/min, 4C，3min)收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗許3次后,用0.5%甲醛滅活過(guò)夜，經(jīng)洗滌后，用生理鹽水調節菌體依度為1X 109 efu/ mL.1.3免疫將包含1x 109 cfu/mL的菌液與等體積的完全福氏佐劑充分混合形成油包水體系，四點(diǎn)注射法對母雞進(jìn)行初次免疫，每次1mL.2周后，以不完全福氏佐試劑代替完全福氏佐試劑進(jìn)行二次免疫,每周1次，持續3周. ELISA檢測特異性卵黃抗體的效價(jià).初次免疫后開(kāi)始收集雞蛋, 4七保存備用.1.4 水溶性蛋白組分的制備將免疫后的雞蛋蛋贊液用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0. 04 mol/L, pH6.0)稀釋10倍[9], 4乜下靜置過(guò)夜，沉降后的上清液加助濾劑經(jīng)0.22 pm膜上過(guò)濾，濾液經(jīng)截留分子量為70 000的超濾膜超濾脫鹽濃縮8倍制備成水溶性蛋白組分(WSF).最后添加0.02%的迭氮鈉于4個(gè)下保存.1.5 卵黃抗體的分離純化S mL WSF中,加入4%至10%不同濃度的PEG,完全混合溶解后在4七下靜置30 min,然后在4七下，用10000 r/ min轉速離心6 min,收集沉淀，溶解于5 mL的蒸餾水中,用于隨后的分析.收稿日期: 2001 -03-21作者簡(jiǎn)介:王輝龍(1976-),男，碩士.中國煤化工MHCNMH G福州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第29卷1.5.1抗體回收率及純度分析樣品用高壓液相色譜法進(jìn)行分析，色譜柱是TSK G3000SW,在室溫下，流動(dòng)相為含0. 1 mol/L硫酸鈉的磷酸鹽綬沖液(0.1 mo/L, pH7.0), 流速為0.5 mL/min,檢測波長(cháng)為280 nm.抗體的回收率和純度分別按照下面公式計算:R抗體= (A抗體/Awsr) x 100%P抗體= (A抗體/A總崍) x 100%其中: R抗體是抗體的回收率(%), A抗體是純化后樣品的抗體峰面積, Awsp是水溶性蛋白組分中抗體的蜂面積，P抗體 是抗體的純度, A總峰是純化后樣品中所有峰的總面積.1.5.2特異性抗體 ELISA的檢測特異性抗體活性的檢測參照Cost10]的方法進(jìn)行.1.5.3 SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白的SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳分析是參照Leammli方法[1]進(jìn)行, 4%的濃縮膠, 7. 5%的分離膠,電泳恒壓150V,電泳樣品用G250考馬斯亮藍染色后再按照標準程序褪色.2結果與討論2.1卵黃抗體 的高壓液相色譜法分析表1列出了不同濃度的PEG沉淀WSF所獲表1 PEG 濃度對卵黃抗體回收率和純度的影響得的抗體回收率和純度.隨著(zhù)PEG濃度的提高，wrec/ %A擾體R抗休/%P抗體/%抗體的回收率也提高，但純度隨之下降;聚乙二268 (Aws)醇濃度為5%沉淀時(shí)，可獲得66%抗體回收率,114189抗體純度達92%(圖1和圖2);當聚乙二醇濃度17756)2為10%時(shí)，抗體純度為85%，但可獲得99%的19774抗體回收率.這是由于PEG的加入，產(chǎn)生空間位阻效應[12),促使蛋白積聚沉淀，而且蛋白的分子2077790量越大越被PEG沉淀[13];抗體的分子量大，因227858此，在低濃度PEG的時(shí)候，抗體首先被沉淀,當257)686PEG濃度升高時(shí)，抗體沉淀量增大,但同時(shí)低分1026599子量的雜蛋白的沉淀量也加大,純度也就下降.0.300 I0.300 tlg)0.2000.200 |0.1000.000w.0.0020.0035.0035.00 .1/min圖1抗體樣品(5%PEG沉淀)的HPLC色譜圖圖2 WSF 的HPLC色譜圖中國煤化工MHCNMHG第S期土輝龍等:聚乙二醇一步沉淀捉取卵黃抗體125。2.2特異性抗體 的檢測圖3是符異性抗體活性回收率的檢測結果.為了便于比0.8較，WSF和PEG提取的抗體樣品在ELISA檢測時(shí)秘邦相同的倍數.雖然經(jīng)PEG沉淀后抗體量有所損失,但足提純后的0.6抗體去除了雜質(zhì)的干擾ELISA值較高，這與相關(guān)文獻報道相華 04符14.15].022.3 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析從圖4可以看出，經(jīng)PEG一步沉淀提取后。樣品中的主WSF4s678.910要蛋白帶分子最為180 kD左在，這與相關(guān)文獻報道相符(S].圖5是WSF的電泳蛋白分布圖。圖6是WSF與用不同濃度的PEG沉淀WSF后的上清液的電泳圖，當PEG的濃度達到圖3不同濃度的PEG提收抗體的活性與10%時(shí)，上清溶液中無(wú)明顯的抗體帶.WSF中杭體活性比較4%5%6%7%。8%9%10%WSFWSF5% 6% 7% 8% 9% 10%IgY- 200kDgY- 130kD- 97.4kD- 66.2kD-43kD圖4用不同濃度 PEG提收的抗圖S WSF 與標準蛋白的圖6 WSP 與用不同濃度PEG沉淀體的電泳圖電泳圖WSF后上情液的電狀圖3結語(yǔ)采用PEG一步沉淀法提取卵費抗體,能夠獲得較高的抗體回收率和純度.用5%的PEG能夠獲得66%的抗體回收率，純度達92%;用10%的PEG濃度時(shí)，純度為85%，但是能夠獲得WSF中99%的抗體，并且該方法可以在不需要經(jīng)過(guò)任何色譜分離的情況下，根據不同需要靈括應用，這在大規模制備卵黃抗體方面具有很大的應用價(jià)值.參考文獻:[1] BenmnHN, Brufield HP. 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Theantibody recovery was close to 100% and the antibody purity was up to 85 % by employing 10% PEG withoutusing any chromatography, while the activity of IgY wasn' t afected by PEG.Keywords: egg yolk antibody; polyethylene glycol; precipitation; purification(接笫118頁(yè))The application of egg - yolk antibody on preventing and curing tryonyx sinensis diseaseCHEN Qiang', ZHOU Jian - wu', RAO Ping - fan', LIN Jin - zhong?(1. Institute of Biotechnology, Fuzhou University, Fuzbou, Fujian 3500020, China; 2. Institute of Fishery Science, Putian,Fujian 351100, China)Abstract: The article discusses the applcation of egg yolks specific antibody on preventing and curing tryonyxsinensis disease. Immunized chicken produced high titer egg - yolk antibody in the eggs. Lyophilization haslittle effect on the activity of antibody. It was shown by invitro bacteriostatic experiment that egg yolk specificantibody had high inhibitory activity on the growth of Aeromonas hydrophila. Passive immunizationexperiment demonstrated that the secific antibody exhibited satisfactory effects on tryonyx sinensis disease.Keywords: tryonyx sinensis; aeromonas hydrophila; eggs yolk antibody; passive immunization中國煤化工MYHCNMHG