聚乙二醇修飾干擾素α 2b的穩定性研究

聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩定性研究姚文兵,林碧蓉,沈子龍,吳梧桐(中國藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院江蘇南京210009 )摘要:目的研究聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩定性。方法以抗病毒活性為指標考察單修飾干擾素a 2b、多修飾干擾素a2b和干擾素a2b的穩定性(4C、25C、37C)抗胰蛋白酶水解能力和37C人血清穩定性。結果在4C、25C和379C條件下穩定性依次為多修飾干擾素a2b>單修飾干擾素a2b>干擾素a 2b?？挂鹊鞍酌杆庠囼灡砻?干擾素a2b在30min時(shí)抗病毒活性迅速降到原來(lái)的7.1%單修飾干擾素a2b剩余50%多修飾干擾素a2b仍保留71%。體外穩定性試驗表明在37C人血清放置10h干擾素a2b只保留35%單修飾干擾素a 2b保留71% ,而 多修飾干擾素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。結論聚乙二醇修飾可以增加干擾素a 2b的穩定性抗胰蛋白酶水解能力和379人血清穩定性。除了抗胰蛋白酶水解能力修飾度的增加能夠明顯增強這種作用。關(guān)鍵詞:干擾素a2b;聚乙二醇修飾干擾素a 2b ;穩定性;抗中國煤化工中圖分類(lèi)號:Q78文 獻標識碼:A文 章編號:1005-1678MYHCNMHG收稿日期:2001-07-10;修回日期2001-10-20作者簡(jiǎn)介;姚文兵( 1962年出生)男生化藥學(xué)博士主要研究方向為塾薩工程藥物的分子修飾天然生物藥物的研制中國生化藥物雜志Chinese Jourmal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期93Study on stability of polyethylene glycol-IFN a 2b conjugatesYAO Wen-bing LIN Bi-rong SHEN Zi-long ,WU Wu-tong( School of Bio-pharmaceutics , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ,China )Abstract Purpose The research was developed to evaluate the stability of polyethylene glycol -IFIN a 2b con-jugates . Methods Anti-viral activity is used as an index to evaluate the thermal stability( at 4C ,25C and37C ) , and the ability of avoiding the trypsin digestion and stability in vitro( at 379C in human serum ) ofmono-PEG-IFN a 2b and poly-PEG-IFN a 2b , then it is compared with IFN a 2b. Results Poly- PEG-IFN a .2b is thermally more stable than mono-PEG-IFN a 2b , and mono- PEG-IFN a 2b more stable than IFN a 2b.The test of anti-trypsin digestion suggests that poly-PEG-IFN a 2b retains 71 % of its anti-viral activity 1 ,mono-PEG-IFN a 2b 50% , IFN a 2b only 7.1 % 30 minutes after being reserved in trypsin solution. Stabilityin vitro indicates that the anti-viral activity of poly-PEG-IFN a 2b is reduced to 95% , mono-PEC-IFN a 2b71% and IFN a 2b 35% 10 hours after being preserved in human serum at 37 C . Conclusion Polyethyleneglycol-IFN a 2b conjugates have improved thermal stability ,ability of protecting from trypsin digestion and sta-bility in vitro . Moreover , the higher the degree of modification , the more stable the IFN a 2b conjugates exceptin the test of anti-trypsin digestion.Key words :IFN a 2b ; Polyethylene glycol -IFIN a 2b conjugates ; Stability ; Anti-viral activity.基因工程藥物的藥物傳遞系統一直 是國內外研單層貼壁生長(cháng)2d以上傳代于10%小牛血清RPMI究的熱點(diǎn)其中修飾技術(shù)的發(fā)展相當迅速并且不斷1640培養液中生長(cháng);冰泡性口腔炎病毒,VSV 病毒,的成熟起來(lái)。聚乙二醇修飾技術(shù)運用單甲氧基聚乙自行繁殖,- 70C保存。二醇經(jīng)過(guò)活化帶上親電基團,與蛋白質(zhì)分子.上的親人血清南京市血站小牛血清杭州四季青生核基團(如自由氨基和末端氨基)共價(jià)結合，從而改物工程材料研究所;RPMI 1640 美國Life Technolo-變蛋白質(zhì)的生物化學(xué)性質(zhì)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)。據文獻報gies公司:胰蛋白酶華美生物工程公司、Serva進(jìn)口道1]聚乙二醇修飾可以改變蛋白質(zhì)的穩定性、水溶分裝。性、生物活性、體內半衰期和免疫原性。人重組干擾2方法素a2b是一種多功能細胞因子具有廣譜抗病毒、2.1 熱穩定性抗腫瘤和免疫調節等生物活性,臨床上用于治療慢取干擾素a2b單修飾干擾素a 2b和多修飾干性肝炎和毛細胞性白血病等病毒性疾病和腫瘤。但擾素a 2b溶液，分別于4C、25C和37C放樣定時(shí)是人重組干擾素a2b不具有天然干擾素的糖基化取樣0.3 ml ,- 20°保存。取樣時(shí)間見(jiàn)表1。同時(shí)測結構,生物半衰期短產(chǎn)生中和抗體高,臨床應用受定各時(shí)間點(diǎn)的抗病毒活性4]。結果以活性保留百分到了限制。前文已經(jīng)報道231活化聚乙二醇的合數表示。成修飾反應條件的優(yōu)化和聚乙二醇修飾干擾素a表1熱穩定性試驗取樣時(shí)間2b的分離純化。本文將著(zhù)重考察干擾素a 2b( IFNa溫度(C)取樣時(shí)間2b),單修飾干擾素a 2l( mono- PEG-IFNa 2b )和多修0.2.4.6、8、10、14、18、24、30 d飾干擾素a 2H( poly- PEG-IFNa 2b )的穩定性從中探250.0.5、1、24.6.810 d索聚乙二醇修飾對干擾素a 2b的作用規律。370、1、2、4、6. 8、12、24、48、72 h _1材料2.2抗胰蛋 白酶水解能力單修飾干擾素a 2l( 1.05x 10° IU/ml 37.5 puf/中國煤化工市干擾素a 2b和多修ml純度95%以上)多修飾干擾素a 2l(0.63x 106飾干MYHCNMHG0.1%胰蛋白酶溶液IU/ml ,37.5 pμg/ml 純度95%以上),自制;干擾素a0.8 ml混勻,37C保溫,于0、3、5、10、15、30、60、9021( 90 pg/ml ,4. 6x 108 IU/mg )，天津華立達生物工min取樣0.1 ml立即與無(wú)血清RPMI 1640培養基混程有限公司批號981202。勻以終止胰蛋白酶的作用。取0.1% 空白胰蛋白人羊膜細胞周wish細胞,自行繁殖在培養基中酶溶液0.1ml,用無(wú)血清RPMI1640培養基稀釋10294中國生化藥物雜志Chinese Journal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期倍，作為空白對照與各時(shí)間點(diǎn)的供試品同時(shí)測定抗3.1 熱穩定性病毒活性4] ,以校正結果。結果以活性保留百分數在4C放置12d干擾素a 2b抗病毒活性只剩表示。9.9% ,單修飾干擾素a 2b的抗病毒活性保留2.3 37°C 人血清穩定性33.5%多修飾干擾素a 2b的活性仍保留91%(圖分別取干擾素a2b、單修飾干擾素a2b和多修飾1a)在25C放置4d ,干擾素a 2b的抗病毒活性只干擾素a 2b溶液0.2 ml與處理過(guò)的無(wú)菌人血清0.8剩14%單修飾干擾素a 2b保留31%的抗病毒活ml混勻37°保溫于0、3.6 12、24.36.72 h取樣0.3性,而多修飾干擾素a 2b的活性仍有71%(圖1b)ml ,- 20C保存。以空白人血清作對照同時(shí)測定抗在37°C放置8 h多修飾干擾素a 2b的抗病毒活性病毒活性4]結果以活性保留百分數表示。保留100%單修飾干擾素a 2b為80%而干擾素a3.結果2b2 h只剩下20%(圖1c)120R 10010030130 180 Hxoo-D.D5101520253035°24681012u5610152025 30時(shí)間/b& 4Cb 25Cc 37C圖1干擾素a 2b(-◆-)、單修飾干擾素a2b(-■-)、多修飾干擾案a 2b(-▲-)在不同溫度下的穩定性因此聚乙二醇修飾能夠在不同程度上增強干1201擾素a2b的穩定性修飾程度的增加可以加強這種00作用尤其在4C。3.2抗胰蛋白酶水解能力在相同的測定條件下胰蛋白酶對干擾素的活性檢測并不存在明顯干擾。干擾素a 2b在30 min010203040508070800100時(shí)抗病毒活性迅速降到原來(lái)的7.1%,單修飾干擾時(shí)間/min素a2b剩余50%多修飾干擾素a2b仍保留71%。圖3干擾素a_b(-◆-)單修飾于擾素a 2b(-■-)、因此聚乙二醇修飾能夠明顯增強干擾素a2b抵抗多修飾干擾素a 2b(-▲- )在人血清中的穩定性(37C)4討論耐胰蛋白酶水解的能力。但是修飾程度的增加對這人重組干擾素a 2b是由165個(gè)氨基酸組成的單種能力的加強作用并不顯著(zhù)。見(jiàn)圖2。鏈多肽理論相對分子量為19237 D,含4個(gè)Cys殘12基形成2個(gè)分子內二硫鍵Cys1與Cy98和Cys2910與Cys138其中Cys29 ~ Cys138之間的二硫鍵對干擾a2b形成特定的立體結構和表現生物活性比較重要。干擾素a2b等電點(diǎn)在5~6之間在pH2.5的溶液中穩定在0. 1% SDS中穩定對熱亦穩定對各010203040500708090100種蛋白酶敏感。由人體正常白細胞分泌的干擾素a.時(shí)間/mnin2b已經(jīng)糖基化,但在大腸桿菌中表達的干擾素a 2b圖2干擾素 a 2b(-◆-)、單修飾干擾素a 2b(-■-)則未糖基化,且在N末端多一個(gè)甲硫氨酸。人重組多修飾干擾素a 2b(-▲-)的酶解穩定性干擾素a2b與天然干擾素a2b的抗病毒活性沒(méi)有3.3 37 C人血清穩定性明顯中國煤化工奏a 2b進(jìn)行了聚乙二在相同的測定條件下血清對干擾素的活性檢醇修MYHCNMHG特征可能會(huì )發(fā)生某種測沒(méi)有顯著(zhù)干擾。在379C人血清放置10h,干擾素改變。對聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩定性研究,a 2b只保留35%單修飾干擾素a2b保留71% ,而從一個(gè)側面將有助于理解聚乙二醇修飾對干擾素a多修飾干擾素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。見(jiàn)2b理化性質(zhì)的影響。圖3。聚乙二醇修飾干擾素a2b的抗胰蛋白酶水解姚文兵等.聚乙二醇修飾干擾素a 2b的穩定性研究295能力比干擾素a 2b明顯增強,這與文獻[2]報道一可能具有較長(cháng)的生物半衰期。致。這可能是由于SC-PEG只能進(jìn)攻干擾素a 2b分參考文獻子里的親核基團(如自由氨基) ,而含有親核基團多[1 ] Bailon Ps ,Palleroni AV. Interferon conjugates[ P] . EP 0 809 996，數為各種堿性氨基酸殘基(如Lys ,His ,Arg ) ,它們均[2]田北立斤號坯垌笙取7-醇對干擾素a2b的初步修飾1997-03-12.是胰蛋白酶的作用位點(diǎn)。一旦蛋白分子里引入PEG .中國煤化工30( 1)74~ 77.分子作為空間屏障能夠阻礙胰蛋白酶的靠近,而[3]林RYHCNMHG醇對干擾素a2b的分離純.免受水解?；疛].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2001 ,31( 4)310~ 312.聚乙二醇修飾干擾素a2b的體外穩定性試驗[4]中華人民共和國衛生部.中國生物制品規程一部[ M]. -九九比干擾素a2b的明顯增強。它與抗胰蛋白酶水解五年版. 北京中國人口出版社,1995 .268 ~ 269.能力試驗的結暴居同暗示聚乙二醇修飾干擾素a 2b[5]吳梧桐J錫申,劉景晶.基因工程藥物一 基礎與臨閑M].北京人民衛生出版社,1996. 160.