AmpliDet RNA技術(shù)

中國生物工程雜志第23卷第12期CHINA BIOTECHNOLOGY2003年12月AmpliDet RNA技術(shù)劉春燕*陳慶山梁秀瑞張立軍李文濱(東北農業(yè)大學(xué)大豆研究所150030)Q7 A摘要隨著(zhù)分子生物學(xué)發(fā)展,核酸實(shí)時(shí)定量檢測已成為人們研究的 熱點(diǎn)問(wèn)題。分子標燈與NASBA結合實(shí)時(shí)檢測ssRNA發(fā)展成為一種新技術(shù)，稱(chēng)為AmpliDet RNA。就NASBA擴增原理、分子標燈的結構和AmpliDet RNA的特點(diǎn)及應用作一簡(jiǎn)單介紹。關(guān)鍵詞分子標燈 NASBA AmpliDet RNA sRNA隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,核酸體外擴體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促過(guò)程。反應在.增巳在各實(shí)驗室得到普及應用,進(jìn)而在擴增過(guò)程中42C進(jìn)行,擴增速度與PCR -樣快,在3h內可擴增做到實(shí)時(shí)定量檢測已成為人們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。1000萬(wàn)倍(1。NASBA技術(shù)均-.地等溫擴增特性擴目前核酸檢測常用的方法有DNA印跡、RNA印跡、大了它的應用范圍,并且用NASBA擴增雙鏈DNA酶聯(lián)免疫法(ELISA)等,這些技術(shù)操作繁瑣復雜,費也已有報道。時(shí),技術(shù)難度大,而且難以對核酸進(jìn)行準確定量檢NASBA反應依賴(lài)于A(yíng)MV反轉錄酶.RNA酶H、測"。而分子標燈是與PCR、 RT-PCR、NASBAT,RNA聚合酶共同協(xié)作完成,標準的NASBA反應( nucleic acid sequence- based amplification) 相結合進(jìn)體系除以上3種酶外,還應有脫氧核糖核苷三磷酸行核酸定量檢測的一種新技術(shù)。其中分子標燈與(dNTP)、核糖核苷三磷酸(NTP)、兩個(gè)特殊的引物NASBA結合是一種實(shí)時(shí)檢測特異單鏈RNA和適宜的緩沖液。其中引物I 3’端與靶序列互補，(ssRNA)的有效方法，這種新技術(shù)稱(chēng)為AmpliDet5'端具有被T,RNA聚合酶識別的啟動(dòng)子序列,引物RNA,現已在許多診斷研究方面得以應用”。II的5'端序列與靶RNA序列相同5.6]。NASBA技術(shù)是體外等溫擴增ssRNA 的酶促過(guò)程。NASBA整個(gè)反應分為兩相:非循環(huán)相和循環(huán).該反應依賴(lài)于A(yíng)MV反轉錄酶(AMV-RT)、RNA酶H相。如開(kāi)始用RNA靶序列,反應將如此進(jìn)行:首(RNaseH)、T,RNA聚合酶(T, RNA polymerase)共 同先,5'端含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的引物I與協(xié)作擴增反義原靶序列RNA。分子標燈是一種與靶序列復性,并由反轉錄酶催化產(chǎn)生一cDNA鏈,核酸雜交能產(chǎn)生熒光的一種新 型探針'”。分子標以RNaseH降解新生成的雙鏈螺旋中的RNA,這樣燈與NASBA結合能高通量檢測核酸,同時(shí),擴增與生成了帶有啟動(dòng)子序列的eDNA,稱(chēng)為非循環(huán)相。檢測在同- - 封閉管內進(jìn)行,臧少了核酸交叉污染的然后,引物I與裸露的cDNA復性,進(jìn)行第二鏈的危險,減少中間操作步驟,省時(shí)省力?，F將分子標合成,啟動(dòng)子序列變?yōu)殡p鏈。這時(shí), RNA聚合酶可燈技術(shù)與NASBA反應原理及AmpliDetRNA定量檢以合成一反義原靶序列的多個(gè)拷貝啟動(dòng)子序列。.測核酸的應用作一簡(jiǎn)述。反過(guò)來(lái),它們又可作為反應循環(huán)相中cDNA合成模板,繼續合成反義原靶序列RNA。過(guò)程見(jiàn)圖1。1 NASBA擴增反應原理NASBA的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,不需特殊儀器,不NASBA(依賴(lài)核酸序列的擴增)是AmpliDet需溫度循環(huán)，整個(gè)反應過(guò)程由三種酶控制,循環(huán)次RNA技術(shù)中擴增目的RNA片段的步驟。1990 年由數少,忠實(shí)性高。由于反應不需高溫變性步驟,所.Guatelli首次提出的由一對引物指導的連續均一的以NASBA不會(huì )受到雙鏈DNA的污染。同時(shí)由于外來(lái)雙鏈DNA無(wú)T,啟動(dòng)子序列,不可能被擴增，這就大大提高了NASBA反應的特異性,適于檢測收稿日期:2003-08-04修回 日期2003-09-24*電子信箱:eyliucn@ botmail. com中國煤化工TYHCNMHG第12期劉春燕等:AmpliDet RNA技術(shù)79RNA引物I.↓rT 5'非循環(huán)相RNA:DNA↓RNase HDNA(-)|3'- 5引物,Ty RNA polymerase循環(huán)相T, RNA polymerase/3'"一5' 引物1IRNA()3'-RTxTDNA(+)引物1RNase H圈1 NASBA 反應過(guò)程{圈中引物I傾斜部分為T(mén)7啟動(dòng)子序列)核酸存在時(shí),分子標燈保持莖環(huán)結構,熒光基團與2分子 標燈的結構及作用原理淬滅基團距離較近,產(chǎn)生的熒光能量根據熒光共振分子標燈(molecular beacon)自1996 年問(wèn)世以能量轉移原理轉移到淬滅基團,并且以熱能的形式后,已廣泛應用于PCR反應的實(shí)時(shí)檢測、活體細胞散發(fā)出去,從而檢測不到或僅有微弱熒光本底。當中DNA-RNA雜交的實(shí)時(shí)檢測、DNA突變分析等[']。靶核酸存在時(shí),莖部結構由于環(huán)狀部分結合靶序列分子標燈在A(yíng)mpliDetRNA技術(shù)體系中與NASBA擴而被打開(kāi)，熒光基團與淬滅基團分開(kāi),熒光產(chǎn)生。增子雜交產(chǎn)生熒光,從而對NASBA擴增反應產(chǎn)物分子標燈檢測核酸的三大特點(diǎn)是特異性、信號進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。放大和產(chǎn)生熒光[回。熒光產(chǎn)生依賴(lài)于分子標燈莖分子標燈是根據核酸堿基配對原則和熒光共環(huán)結構的穩定性,而前兩者則依賴(lài)于探針與目標分振能量轉移( fluorescence resonance energy transfer,子雜交的長(cháng)度及莖部的穩定性。FRET)現象設計的17.8。分子標燈為一莖環(huán)結構的3 AmpliDet RNA特點(diǎn)及應用寡核甘酸探針,其環(huán)狀區核甘酸序列與靶序列互補,靠近兩端的部分序列構成分子標燈的莖部,大3.1 AmpliDet RNA特點(diǎn)約有5-7個(gè)堿基對,兩端分別標記熒光基團分子標燈與NASBA結合應用技術(shù)被稱(chēng)為(fluorophore)和淬滅基團(quencher)(圖2)。沒(méi)有靶AmpliDet RNA技術(shù)。該技術(shù)與RNA印跡等方法比.擴增子RNA8°分子標燈圈2分子標燈的作用模型F(furophore)熒光基團;Q( quenche)誶滅基團中國煤化工TYHCNMHG80中國生物工程雜志第23卷較, AmpliDet RNA具有相同的特異性與靈敏度,并通過(guò)凝膠電泳后經(jīng)Northem雜交進(jìn)行檢測。而另便易于操作。由于整個(gè)過(guò)程在微量封閉的離心一份通過(guò)分子標燈進(jìn)行檢測,證明AmpliDetRNA管內進(jìn)行,消除了核酸交叉污染的可能。AmpliDet檢測準確可靠,靈敏度更高,并且易于操作。由于RNA除了能實(shí)時(shí)檢測sRNA外，還可應用到其他分子標燈在反應開(kāi)始就需加入到反應管內,這就有許多方面,如:生物活性的預測、基因表達、細胞生可能由于分子標燈與擴增子的雜交而阻滯了存力的檢測等。根據AmpliDet RNA的原理和目前NASBA反應體系繼續進(jìn)行,因此應對實(shí)時(shí)檢測的實(shí)驗結果，與常規核酸檢測方法相比,AmpliDetNASBA反應進(jìn)行優(yōu)化。Cionate Leone 通過(guò)設計具RNA具有以下特點(diǎn)。(1)液相雜交檢測:常規檢測有不同結合位點(diǎn)的分子標燈和引物來(lái)克服這一現方法主要為固相雜交,通常把核酸片段變性后轉移象,并檢測了從100pg 到10fg-系列稀釋10倍的.并固定于支持膜上,用標記探針進(jìn)行雜交[10]。因PLRV病毒RNA。此要把未結合的探針和引物分離后才能利用其他3.2.2多 重AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測多個(gè)目的基因信號對靶核酸進(jìn)行檢測。而AmpliDet RNA可以直或核酸的不同位點(diǎn)同時(shí)檢測在植物疾病 診斷過(guò)接在紫外燈下或借助熒光光譜儀進(jìn)行定量檢測。程中,分子標燈的應用已較為普遍。該技術(shù)能靈敏(2)準確性高:分子標燈與NASBA結合實(shí)時(shí)檢測核的檢測到微量的植物病原體。在植物發(fā)病過(guò)程中，酸要優(yōu)于分子標燈與PCR或RT-PCR結合檢測核不單是由一種病原體致病,有可能是幾種病原菌共酸。這是因為NASBA是連續均一的等溫擴增過(guò)同作用導致植物發(fā)病的。因此利用多重檢測技術(shù)程,反應在42C進(jìn)行,這就省去了在PCR和RT-同時(shí)檢測幾種病原菌顯得尤為重要。在利用PCR反應中高溫變性的步驟,排除了分子標燈因高AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測單-目的基因的基礎上,發(fā)溫變性而使雜交莖部打開(kāi)產(chǎn)生熒光的可能。也就展了多重AmpliDet RNA技術(shù)。在具有不同目的基是說(shuō)只有分子標燈的環(huán)狀序列不斷與擴增子雜交因的反應管中加人帶有不同顏色熒光基團的分子才能產(chǎn)生熒光信號,提高了實(shí)時(shí)檢測RNA的準確標燈進(jìn)行檢測。常用的熒光-淬滅分子對有:香豆性。(3)特異性強:在對分子標燈與靶序列雜交特素(藍色)-DABCYL; EADNS(藍綠)- DABCYL;熒光異性研究中發(fā)現,與線(xiàn)性寡核苷酸探針相比，莖環(huán)素(綠色)-DABCYL;熒光黃-DABCYL;四甲基羅丹狀結構的分子標燈檢測特異性高，對靶序列中單個(gè)明(橙色)_DABCYL;得克薩斯紅- DABCYL等。經(jīng)實(shí)堿基的錯配、缺失或插人突變均能檢測出來(lái)。(4)驗證實(shí),這個(gè)技術(shù)體系的可靠性和靈敏性要高于酶靈敏度高: AmpliDet RNA能檢測到低至1拷貝的核聯(lián)免疫( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)酸,敏感性很高。(5)對 靶核酸實(shí)時(shí)檢測:在NASBA檢測和Northerm雜交等技術(shù)。由于NASBA擴增技體系中加入分子標燈,并把擴增儀與熒光光譜儀相術(shù)比RT-PCR靈敏,同時(shí)AmpliDet RNA不使用凝膠連,可以對NASBA反應過(guò)程隨時(shí)進(jìn)行檢測。(6)有檢測，使得該技術(shù)優(yōu)于多重RT-PCR檢測技術(shù)"。效消除核酸交叉污染:利用分子標燈可以直接對封Klerks等8已利用該技術(shù)成功地同時(shí)檢測了馬鈴閉微量離心管進(jìn)行檢測,完全避免核酸中間操作環(huán)薯卷葉病毒(PLRV)和馬鈴薯病毒Y(PVY)兩種病節,徹底消除核酸交叉污染。(7)可大通量的檢測毒的核酸含量。在同時(shí)檢測馬鈴薯兩種病毒時(shí)，核酸:NASBA與分子標燈結合可實(shí)現核酸的大規Klerks等通過(guò)在反應管內加入低濃度內參照物IPC .模自動(dòng)化檢測。來(lái)消除假陽(yáng)性。IPC序列與目標RNA幾乎相同,但3.2 AmpliDet RNA檢測核酸的應用有3~20個(gè)核苷酸的差異,用具有不同熒光基團的3.2.1 AmpliDet RNA能均一的實(shí)時(shí)檢測單一目的分子標燈來(lái)檢測IPC擴增子。所以在擴增檢測中RNA在NASBA擴增體系中應用分子標燈可隨著(zhù)應始終有IPC的熒光信號產(chǎn)生,這樣進(jìn)一步提高了擴增的進(jìn)行均一的產(chǎn)生熒光信號。這是因為.AmpliDet RNA技術(shù)的準確性。Eun AJC等[12}設計NASBA是連續均一的等溫擴增過(guò)程,使分子標燈了4種分子標燈同時(shí)檢測了蘭花花葉病毒的環(huán)狀序列不斷與擴增子雜交產(chǎn)生熒光信號進(jìn)行(CymMV)和蘭花環(huán)斑病毒( ORSV)兩種病毒中RNA實(shí)時(shí)檢測。Gionate Leone 等[2}已把AmpliDet RNA依賴(lài)的RNA聚合酶基因和病毒外殼蛋白基因。該成功應用于馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的核酸定量檢技術(shù)在兩病毒共侵染的100mg蘭花葉片中同時(shí)檢測。在實(shí)驗中NASBA擴增子被均分為兩份,一份中國煤化工毒。多重AmpliDtfYHCNMHG第12期劉春燕等:AmpliDet RNA技術(shù)81RNA技術(shù)成功地應用到了蘭花產(chǎn)業(yè),為蘭花的抗. [ 2 ]Gionate Leone, Harm van Schjnde, Bob van Gemen .e1 al .病育種提供了先進(jìn)的手段。由此可見(jiàn)，多重Molecular beacon probee combined with amplification by NASBAenable homogeneous, ral-time delectio of RNA. Nucleic AeidaAmpliDet RNA技術(shù)可應用到不同作物的多個(gè)病毒Reearch, 1998 ,26 (9):2150- 2155.檢測。多重AmpliDetRNA不僅可以對多個(gè)病毒同[ 3 ]Tyagj S,Kramer F R. Molecular beaconsprobes ihat fuoresce upon時(shí)檢測,還可以檢測同一病毒的不同株系。Szemeshybridizaion. Nat Biolechnol, 196,14(3):303 - 308等川采用NASBA擴增馬鈴薯病毒Y(PVY)中編碼[ 4 ]Compton J. Nucleic acid Bequence based aplifcation.n Noture,外殼蛋白基因并用分子標燈檢測成功地分離了1991.350:91 -92PVY~、PVYorC.、PVYT三種株系。同時(shí)利用該技術(shù)[5]顏進(jìn).NASBA及其在醫學(xué)上的應用.國外醫學(xué).臨床生物化成功地分離了來(lái)自6個(gè)國家的47個(gè)PVY株系,經(jīng)學(xué)與檢驗學(xué)分冊1997.18 (2)6-6-6驗證,分離結果與這些株系的生物性狀一致,準確[ 6]Kierils T, van Gemen B, van Strjp D.et al. NASBA isothermal可靠。enzymatic in vitronucleie acid amplfcation opimized for HIV-I3.2.3利 用AmpliDet RNA檢測單核苷酸多態(tài)性dingnois . Jourmal of Virological Methods, 1991 ,35(3) :273 ~ 286[ 7 ]Tan W.Fang X,Li J, et al. Molecular beacons:a novel DNA probe(SNP)14.51隨著(zhù)人類(lèi)基因組計劃研究進(jìn)展,已經(jīng)for nucleic acid and prolein studies. Chemistry 2000.6(7);1107 -在人類(lèi)基因組中鑒定出200多萬(wàn)個(gè)SNP。由此可1111以推知,在植物、動(dòng)物的基因組中也存在一定量的[8]Klerks MM，Leone GO, Verbek M,er al. Derelopment of aSNP。而且這些SNP在植物進(jìn)化、生長(cháng)發(fā)育、抗病muliplex AmpliDet RNA for the sinultaneous decction of potato性等方面起著(zhù)重要作用。這使SNP成為基因研究leafroul vinus and potato vinus Y in potato tubers. Journal of的有利工具。對這些SNP近一步的研究具有深遠Virologcal Methods ,2001 ,93(1-2):115- 125意義。利用分子標燈與NASBA結合檢測的優(yōu)點(diǎn)是[ 9 JSsemes M, Schoen CD. Design of molecular beacons for AmpliDet可以把多個(gè)樣品集合同時(shí)檢測，對微量樣品的檢測RNA asay Charceriration of binding sability and probespeificity. . Analyical Biochemistry , 2003 ,315(1~ 2):189 ~ 201具有很高的靈敏度。[10]劉明軍,王立榮,王兆五.核酸定量檢測技術(shù)的進(jìn)展及應用.3.2.4利用 AmpliDet RNA實(shí)時(shí)檢測目的DNA分醫學(xué)信息200.10 (6) :340-342子NASBA技術(shù)傳統上是擴增ssRNA行之有效的[11]Burchill SA,erebolte L,Jobnston C. et al Comparison of the RNA-方法。但現在有一些實(shí)驗室也采用NASBA技術(shù)擴amplifcation based methods RT-PCR and NASBA for the dection增雙鏈DNA。只要反應中加人變性步驟,即在等溫of cireulaing tumor cll. British Journal of Cancer,2002, 86 (1):反應進(jìn)行前使雙鏈DNA分子變性成為單鏈,同時(shí)102- 109在引物設計、樣品的提取方法和模板變性等方面做[12] Alrin Jin Cheng Eun, Sek-Man Wang. Moleular beacons: A new一些修改,就可以利用NASBA有效擴增雙鏈DNAepproech to plat virus dection. Pyopahlgyy .20090(3) :269- 275分子。用AmpliDet RNA檢測DNA分子優(yōu)點(diǎn)為反應[13]Szenes M,M klerkes M, van den Heuvel J F] M,et al. Development在一等溫封閉管內進(jìn)行,減少中間操作環(huán)節,免除of a multiplxs AmpliDet RNA 8y for simulaneous deletion and核酸交叉污染的可能,同時(shí)允許高通量檢測目的typing of potato virns Y inlates. Journal of Virological Methods,DNA分子。Yales 等[16]采用AmpliDet RNA技術(shù)實(shí)2002,100 (1-2):83 -96.時(shí)檢測定量了乙型肝炎病毒(HBV),并檢測到了人[14]aras SAE, Kramer FR, Tyaji s . Muliplex deteticon of single-類(lèi)血漿每毫升中HBV DNA 10'~ 10°拷貝不等。該nucleoide varaions using moleular beacons . Cenetic Analysis:方法具有很好的重復性和精確度。與其他DNA檢Bionoleculer Engineing, 199,14(5- 6):l51- 156測技術(shù)相比,AmpliDet RNA具有更好的靈敏性和較[15] Mhlanga MM , Malmberg L. Using mlecular beacons l0 detct大的動(dòng)力學(xué)范圍,并且可以高通量檢測。這使eingle nuclotide polymorphismns with real time PCR. Methods,2001 ,25(4):463 -471AmpliDet RNA技術(shù)在檢測目的DNA分子的應用上[16]Yates s. Penning M, Goudenit J,et al. Quantiative detection of也有廣闊的前景。hepeitis B vins DNA by rel-lime mucleic acid sequence-based參考文獻amplification with molecular beacon delection. Jourmal of ClinicalMicrobiology ,2001 ,39( 10) :3656 - 3665[1]陳忠斌,王升啟,孫志賢.分子信標核酸檢測技術(shù)研究進(jìn)展.(下轉第94頁(yè))生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1998,25(6):488~492中國煤化工MYHCNMHG94中國生物工程雜志第23卷的克隆及結構分析.生命科學(xué)研究,003, 16(3);188 ~ 191[4]F.奧斯伯，R.布倫特,等.精編分子生物學(xué)實(shí)驗指南.北京:[2]朱平,馮書(shū)章.抗體實(shí)驗技術(shù).長(cháng)春:長(cháng)春出版杜,94,415-科學(xué)出版社.1998. 200.565 - 581[s]許崇波.朱平.產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素保護性抗原基因在大腸(3}張智清,姚立紅,侯云德含PRPL啟動(dòng)子的原核高效表達載桿菌中的高效表達.中國普醫學(xué)報, 19919(1):29 -32體的組建及應用.病毒學(xué)報，190612)11116High Expression of Recombinant Alpha-toxin's C-Terminal Gene ofClostridium perfringens Type A in E. coliLin Minghui' Yin Jun2 Xing Hongguang' Hou Xiaojun2 Wang Hui' Song Wei2(1 Laboratory Department of Genernl Hospital of Kunning Kunming 6500322 Institute of Microbiology and Epidemiology Academy of Miliary Medical Sciences Beijing 100071)Abstract After having been cloned and digested by the restriction endoenzyme EcoR I and Pst I , the modifiedalphatoxin' s C-terminal gene was connected with the expression vector pBV220 and then transferred into the host cellE. coli DH5a . Induced by 42 C , the cpa408 gene was highly expressed , which expression amount was to the 43.75percent of the totall bacterial protein. By analysis of SDS-PAGE , the molecular weight of the expression protein is about15.5x 10'Da. Analysised by Westem-blot , the protein could secificly react with the standard anti alpha-toxin.Key words Clostridium perfringens type A Alpha- toxin C- terminal gene High expression(上接第77頁(yè))包涵體復性研究進(jìn)展龔平生羅貴民(吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室長(cháng)春 130023)摘要用基因工程技術(shù)在大腸桿菌 高水平表達重組蛋白時(shí),通常形成無(wú)生物活性的包涵體。包涵體在體外經(jīng)分離、溶解與重折疊后可實(shí)現復性,表現為具有生物活性的蛋白?？偨Y了包涵體的相關(guān)復性技術(shù),重點(diǎn)介紹重折疊的最新進(jìn)展情況。關(guān)鍵詞包涵體 復性重折疊重組蛋白(上接第81頁(yè))The Principle and Application of AmpliDet RNALiu Chunyan Chen Qingshan Liang Xiurui Zhang Lijun li Wenbin(Instiute of Soybean Research Northeast Agriculural Univenity Harbin 150030)Abstract With the development of molecular biology, real-time detection of nucleic acid has become a hotproblem. AmpliDet RNA is a new technology for detecting nucleic acid combined nucleic acid sequence-basedamplification( NASBA) and molecular beacon. The principle of NASBA, the structure of molecular beacon, and thecharacteristics of AmpliDet RNA have been summarized.Key words Molcular beacon NASBA AmpliDet RNA ssRNA中國煤化工MYHCNMHG