聚乙二醇對矮叢越橘愈傷組織抗逆性的影響

吉林農業(yè)大學(xué)學(xué)報2009,31(5):538 ~ 542http :// xuebao . jlau. edu . cnJournal of Jjilin Agricultural UniversityE-mail : jindxb @ vip . sina . com聚乙二醇對矮叢越橘愈傷組織抗逆性的影響孫月明，張志東”，李亞?wèn)|，吳林，劉海廣吉林農業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長(cháng)春130118 .摘要:以矮叢越橘“芝妮"(Chignecto)."芬蒂"(Fundj)為試驗試材。研究了不同質(zhì)量濃度聚乙二醇(PEG)脅迫培養對越橘愈傷組織抗逆性的影響。結果發(fā)現越橘愈傷組織內SOD和CAT酶活性隨著(zhù)脅迫培養時(shí)間延長(cháng)呈現先開(kāi)高后降低的變化趨勢,在100g/L處理第6d時(shí)，“芝妮”和“芬蒂”的SOD活性值最高分別為1 991.9,2 483.1 U/g,CAT活性分別為12.2.11.69 U/(g'min)。2個(gè)品種愈傷組織的POD活性、.MDA與脯氨酸(Pro)含.量均隨處理濃度增加及處理時(shí)間的延長(cháng)星開(kāi)高趨勢。關(guān)鍵詞:越橘;聚乙二醉;愈傷組織;抗逆性.中圖分類(lèi)號: S663.9文獻標識碼: A文章編號: 100-0684(2009)05-0538-05Effect of PEG Stress on Resistance of Lowbush Blueberry CallusSUN Yue-ming, ZHANG Zhi-dong, L Ya-dong, WU Lin, LIU Hai-guangCollege of Horticulture，Jilin Agricultural University, Changchun 130118, ChinaAbstract: The ffect of PEG stress in different concentrations and different stress culture time on blueber-ny callus (lowbush blueberry , Chignecto and Fundy, as experimental samples) was studied. The resultshowed that the trend of diversity of SOD and CAT goes to conformity, which is increased at the first stageand then decreased. When the samples were treated with 100 g/L on the 6th day, the activity values ofSOD of Chignecto and Fundi were respectively 1 991.9 U/g and 2483.1 U/g, the values of CAT wererespectively 12.2 U/(g* min)and 11 .69 U/(g* min). The activity of POD and content of MDA and Prorose up continuously in different time spans and concentrations .Key words: bluebemy; PEG; callus; resistance越橘為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccini-標變化規律,旨在為進(jìn)一步利用PEG開(kāi)展越橘抗um)小漿果類(lèi)果樹(shù),是20世紀發(fā)展起來(lái)經(jīng)濟價(jià)值性誘變育種提供依據。很高的新興優(yōu)良果樹(shù)。越橘是淺根系植物，沒(méi)有.1材料與方法根毛,其根系集中分布在10~ 30 cm的土層。干旱脅迫對越橘生長(cháng)結果影響很大。此外,越橘枝1.1 試驗材料條越冬能力較差,在黑龍江、吉林、遼寧等地區人.供試材料選擇矮叢品種群的“芝妮"(Chignec-工裁培時(shí)必須埋土防寒才能保證枝條安全越冬。.to)和“芬蒂"( Fundy) ,均取自吉林農業(yè)大學(xué)小漿果聚乙二醇( polyethylene glycol, PEG)常 用做植物耐研兗所。旱性選擇劑或水分脅迫劑。1973 年, Heydecker最1.2 試驗設計與方法早成功利用PEG處理蔬菜種子1],此后PEG的滲1.2.1培養基及培養條件采 用WPM( Wod透處理應用于多種作物上且效果顯著(zhù)[251。本試Plant Medium)為基本培養基。除了PEG(北京鼎驗用PEG處理越橘愈傷組織,探討其抗性生理指國生物試劑公司)脅迫時(shí)采用液體培養基外,其余中國煤化工基金項目:公益性行業(yè)(農業(yè))科研專(zhuān)項(nyhya 07-028. 2006- C25),吉林作者簡(jiǎn)介:孫月明,女,碩士研究生.主要從事果樹(shù)生物技術(shù)研究。.MYHCNMHG收稿日期: 2008-12-20 。修回日期: 2009-02-28通訊作者孫月明等:聚乙二醇對矮叢越橘愈傷組織抗逆性的影響539培養均采用固體培養基,添加瓊脂5 g/L,蔗 糖用茚三酮顯色法(6]測出在515 nm下樣品的吸光30 g/L,pH 5.4。培養基在121C,1.1 Kg/cm2 壓度,計算Pro 含量。力下高溫滅菌20 min。培養溫度為(23 +2)C,光2結果與分析照強度為2 000 x,光周期為16 h光照/8 h黑暗。選用PC材質(zhì).直徑為8 cm的培養瓶。PEG 脅迫2.1 PEG 對愈傷組織SOD活性的影響培養時(shí)采用非透氣蓋,其余培養采用透氣蓋。由圖1和圖2可以看出，隨著(zhù)處理時(shí)間的延1.2.2 愈傷組織的誘導 從田間健壯植株上采長(cháng)，兩個(gè)品種愈傷組織內SOD活性值均呈現先升集幼嫩新梢,表面消毒后接種在增殖培養基高后降低趨勢。200 g/L處理較短時(shí)間內SOD的(WPM+ZT 0.5 mg/L)上。繼代后再用增殖培養活性就達到很高的水平,但是隨著(zhù)處理時(shí)間延長(cháng)基培養6周左右。取距組培苗基部約5 cm處新其活性下降明顯,在第8 d時(shí)低于50 g/L處理相梢的葉片,用解剖刀在葉片遠軸面中脈處橫切幾對應的SOD活性值。這說(shuō)明在輕度和中度脅迫刀,但不要切斷葉片。將刀口朝上平鋪在愈傷組時(shí)SOD的活性得到很明顯的提高,并且提高幅度織誘導培養基(WPM +2, 4-D 1.0 mg/L)上。約很大,但是在重度脅迫時(shí)由于自由基積累量增大,10d出現愈傷組織。20d后將產(chǎn)生愈傷組織的葉愈傷組織逐漸不能抵御負離子的傷害,SOD活性片轉移到愈傷繼代培養基(WPM + CPPU逐漸降低。100g/L處理6d時(shí),“芝妮”與“芬蒂"2.0mg/L)上。以后每20d將愈傷組織繼代1次。的SOD活性均達到最高，分別為1991.9,1.2.3 PEC 脅迫方法用第 3次繼代的愈傷組2 483.1 U/g?？椬鳛樵囼灢牧线M(jìn)行脅迫培養。將愈傷組織塊接2500種在PEG質(zhì)量濃度分別為0,50, 100, 150,200 g/L2000的液體繼代培養基(WPM + CPPU 2.0 mg/L)中。1500 |在培養瓶中放置3張濾紙,加人液體培養基30 mL,用非透氣瓶蓋封口后高壓滅菌。每個(gè)瓶?jì)?000接種6塊直徑約3cm、生長(cháng)旺盛的愈傷組織,每個(gè)500處理10瓶。脅迫處理時(shí)間設2,4,6,8 d4個(gè)水平。脅迫結束后將愈傷組織取出后測定其脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物歧化酶t1d+ 50g/;+ -100gL:+150g/L:￥200g/L(POD)、過(guò)氧化氫酶( CAT)及丙二醛(MDA)含量或活性。圖1 PEG處理后“芝妮"愈傷組織SOD活性變化1.2.4測定方法取0.5g脅迫處理后的愈傷.Fig.1. The altration of SOD actity of Chignecto with組織,加少量石英砂和少許磷酸緩沖溶液研磨至.PEG treatment3000勻漿,用磷酸緩沖溶液定容至20 mL。1 000 r/ min離心20min。記錄離心后的液體體積。冰浴保-2500存,用于SOD、CAT、POD、MDA的測定。2 2000~取樣液0.05 mL,采用NBT光化學(xué)還原法[6]B 1500測定SOD活性;取樣液0.2 mL,采用比色法[6]測谷s:定CAT活性;取樣液1 mL,采用愈創(chuàng )木酚法[6)測定POD活性;取樣液5mL,采用硫代巴比妥酸(TAB)法[6]測定MDA含量。稱(chēng)取愈傷組織0.3 g,加入80%酒精研磨,再+ 50g/:+100g/L: +l50gr * 200肌用1mL80%酒精沖洗研缽3次。將液體合并轉.圈2 PEG 處理后“芬蒂"愈傷組織SoD活性變化移到離心管中,在80恒溫水浴鍋中提取20min。中國煤化工1 of Fundy with再向離心管中加人少許活性炭和人造沸石,振蕩YHCNMHG5 min,4 000 r/min離心10 min,取上清液備用。利.吉林農業(yè)大學(xué)學(xué)報Joumal of Jilin Agricultural Unirersity540吉林農業(yè)大學(xué)學(xué)報2009年 10月2.2PEG對愈傷組織CAT活性的影響的積累量少,導致POD活性有所下降。POD 的變.“芝妮”與“芬蒂”經(jīng)不同質(zhì)量濃度PEG處理化趨勢與SOD和CAT不同,這可能是由于POD后CAT活性的變化趨勢與SOD的趨勢大致相同，也可 在逆境或衰老后期表達,參與活性氧的生成，整體呈現先升高后下降趨勢。由圖3可以看出,表現為傷害效應，是植物體衰老到一定階段的產(chǎn)“芝妮"在PEG濃度為150g/L時(shí),CAT的活性明物。顯要高于其他處理,但是在處理后第6d 100 g/L處理的CAT活性超過(guò)150g/L處理,達到最高值Xi 120012.2 U/(g*min)?！胺业佟庇鷤M織內的CAT(圖4)50g/L處理第6d和第8dCAT活性均高于200g/L處理,這與SOD的變化趨勢不相同,這可能是由于200 g/L處理濃度過(guò)高抑制了CAT酶活00年4r2-十50g/L:+ -100g/L:+l50g/L:￥200 g/L8$圍5 PEG 處理“芝妮"愈傷組織POD活性變化Fig.5. The alteration of POD activity of Chignecto withPEG treatmentx14001200)00t1d800+ 50g/L:+-100g/L:+-150g/L:-￥- 200g/L600 I圈3 PEG 處理后“芝妮”愈傷組織CAT活性變化400Fig.3. The ateration of CAT activity of Chignecto with2004「t/d+ 50g/L:+100g/L;→l50gL:-*- 200g/L圈6.PEG處理后“芬蒂"愈傷組織POD活性變化Fig.6. The alteration of POD actity of Fundy with2.4 PEG對愈傷組織MDA含量的影響MDA是植物受到外界脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種衰老產(chǎn)物。由圖7、圖8可見(jiàn),愈傷組織中MDA含量+ 50gL:+ -100gL:+l50g:- * 200gyL均隨處理時(shí)間的延長(cháng)不斷升高。2個(gè)品種50 g/L圖4. PEG處理后"芬蒂”愈傷組織CAT活性變化處理MDA含量隨時(shí)間上升速度均不大,100g/LFig.4. The ateration of CAT activity of Fundy with和150g/L處理上升速度有所加快但仍比較穩定,200 g/L處理第8d MDA含量明顯增加，“芝妮”達2.3PEG對愈傷組織POD活性的影響到0.086 umol/L,“芬蒂"達到0.092 pμmol/L,較.由圖5和圖6可以看出，2個(gè)品種的POD活.50g/L處理第2 d分別增加了29.6 倍和46倍。性均隨著(zhù)PEC處理濃度加大和處理時(shí)間的延長(cháng)這說(shuō)明200g/L處理第8 d時(shí)植物膜透性已經(jīng)明而不斷升高。但由圖6中可以看出，“芬蒂"在顯被中國煤化工150 g/L處理第6d時(shí)POD活性值出現小幅下降,可能是由于此處理SoD與CAT相對較高, H2O2TYHCNMHGJoumal of Jilin Agricultural University 2009，October孫月明等:聚乙二醇對矮叢越橘愈傷組織抗逆性的影響5410.10 r增加4倍。有研究證明Pro的積累是一種可遺傳0.08 t積累,同時(shí)Pro含量的增加利于提高植物抗性。0.060.0412000.02*80040t/d十+ 50g:+100gL;+ 150gLr * 200g/L圍7PEG處理的芝妮越橘愈傷組織MDA活性變化/dFig.7. The ateration of MDA activity of Chignecto with+50g/L;+100g/L:-←150g/L;￥- 200gLPEG treatment圍10 PEG 處理后“芬蒂"愈傷組織Pro含量變化.10Fig. 10. The alteration of Pro activity of Fundy with0.083討論有研究表明,在PEG的脅迫下植物體內SOD0.02活性得到顯著(zhù)提高,這是由于PEG對植物細胞造成了水分脅迫,從而產(chǎn)生大量的自由基,引起SOD酶活性大幅度的提高,以減輕自由基對植物細胞+ - 50g/L:+ -00g:+ 150g/:- * 200gyL的傷害。但是脅迫程度超過(guò)植物細胞所能調節的圍8PEG處理的芬蒂越橘愈傷組織MDA活性變化范圍,SOD活性下降。毛淑蕊[7|利用PEG6000鑒Fig.8. The ateration of MDA activity of Fundy with定花生抗旱性,結果顯示隨著(zhù)PEC濃度的升高,2.個(gè)品種試管苗的SOD活性均呈先升高后下降的2.5 PEG對愈傷組織Pro的影響由圖9和圖10看出,隨著(zhù)處理濃度的增大及趨勢。許桂芳[8]在PEG脅迫對2種過(guò)路黃抗性處理時(shí)間的延長(cháng),兩品種愈傷組織內的Pro含量生理生化指標的影響的研究中發(fā)現,SOD活性得到明顯提高。本試驗驗結果與毛淑蕊的研究一均呈大幅上升趨勢。致,即隨著(zhù)PEG脅迫濃度的升高,愈傷組織的1600SOD活性呈先升高后下降的趨勢。本試驗結果與許桂芳研究結果不一致,其原因可能是由于試驗材料不同。CAT 活性的變化趨勢與SOD相一致,因為CAT的主要功能是清除在SOD催化條件下產(chǎn)生的H202。400POD是植物體內普遍存在的、活性較高的一05種酶,它與呼吸作用光合作用及生長(cháng)素的氧化等1/d有密切關(guān)系。在植物生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中POD的活+ 50g[:+-100g/L:- + 150g/:- * 200g/L性不斷發(fā)生變化,因此研究其活性變化可以反映團9 PEG 處理后“芝妮"愈傷組織Pro含量變化某一時(shí)期植物體內代謝的變化。本試驗中在初期Fig.9. The ateration of Pro activity of Chignecto with輕度和中度脅迫時(shí)POD增多的原因是由于逆境條件中國煤化工戶(hù)細胞。但是隨如“芬蒂”200 g/L處理8d時(shí)Pro 含量達到脅迫MHCNMHG:植物衰老的產(chǎn)1 698.8 r/g,比50g/L處理2 d時(shí)的416.8 prg/g物。爭水強認為rUU的土安作用是作為衰老吉林農業(yè)大學(xué)學(xué)報Joumal of Jilin Agriculural University542吉林農業(yè)大學(xué)學(xué)報 2009年 10月的產(chǎn)物而存在。鞏振輝[10]等人在研究人工老化研究[].種子, 1998. 17 (3): 1-14.和PEG引發(fā)對甜椒種子活力及芽期過(guò)氧化物酶4] 孫耀中,李蘭芬,許濱蓮. PEC滲透調節對小麥種子活力的影晌[J].河北農業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報，1995, 9(4): 71-74.活性的影響時(shí)發(fā)現，PEC引發(fā)能逆轉老化作用,5] 洪法水,王旭明，馬成倉。PEG預處理提高長(cháng)米種子活力和提高種子活力和芽期過(guò)氧化物酶活性。劉志剛等萌發(fā)代謝的效應[J].安徽農業(yè)科學(xué)，1995. 23 (2): 111人叫在研究PEG對蘆筍的影響時(shí)也得到相同的113.結果。本試驗中越橘愈傷組織內的POD活性隨6] 張治安,張美善,蔚榮海.植物生理實(shí)驗指導[M] .北京:中國.脅迫程度的加大而升高,這與前人研究結果-一致。7] 毛淑蕊.利用pEC6000離體鑒定花生抗早性技術(shù)體系的研農業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社.004:132-140.MDA是膜脂過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物,其究[D].山東農業(yè)大學(xué)2008.含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。在PEC8] 許桂芳.PEC脅迫對2種過(guò)路黃抗性生理生化指標的影響的脅迫過(guò)程中越橘愈傷組織內MDA含量一直呈[].草業(yè)學(xué)報，2008,17 (1):66-70.上升趨勢,這與戴高興等人對小麥的研究結果相9] 尹永強,胡建斌,鄧明軍植物葉片抗氧化系統及其對逆境同[12]。輕度脅迫與較高濃度脅迫相比較,MDA的脅迫的響應研究進(jìn)展[J].中國農學(xué)通報,2007, 23 (1): 105- .109.積累速度要慢。這樣說(shuō)明在較高濃度脅迫下,愈[10] 鞏振輝,何玉科,周新民.陳啟林.人工老化和PEG引發(fā)對傷組織中的自由基隨SOD的活性下降而大量積甜椒種子活力及芽期過(guò)氧化物酶活性的影響[].河南職累,導致MDA含量的大幅上升。技師院學(xué)報.192.20 (4):50.56.植物細胞缺水時(shí)Pro含量增加。Pro含量在.[11] 李志剛,劉威.林彰文,顧繼光.蘆筍在PEG模撒干旱條件- -定程度上反映了植株體內的水分情況,因而可下的生理生化變化[J].生態(tài)科學(xué)，2006,25<1):21-24.以作為植物缺水狀況的參考性生理指標。Pro 作[12] 戴高興,彭克勤,簫浪濤. 鄧國富聚乙二醇模擬于旱對耐為植物蛋白的組成部分,當植物細胞受到脅迫時(shí)，低鉀水稻幼苗內二醛、胸氨酸含最和超氧化物歧化酶活性的影啊[J].中國水稻科學(xué)200620<5)55.559.會(huì )大量積累。在干旱和模擬干旱脅迫下,蠶豆和[13] 鮑思偉,談鋒,廖志華.土壤干旱對蠶豆葉片滲透調節能力野生大豆的游離脯氨酸明顯積累(13.141。關(guān)于脯的影響[J].西南農業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001.23(4):353.359.氨酸含量在逆境下產(chǎn)生積累的生理效應有許多不[14] 張美云,錢(qián)吉,鄭師章.滲透脅迫下野生大豆游離脯氨酸和同的觀(guān)點(diǎn)[15-16]。有學(xué)者認為Pro含量叮作為抗旱可溶性糖的變化[J].復旦學(xué)報,2001 ,40(5) :8-561.的指標[16],或者是傷害程度的指標|7],而劉娥娥[1S]馬國良,李軍喬.李炳發(fā).滲透脅迫對克隆植物旅麻游離脯等[18)認為Pro含量應該作為脅迫敏感指標。本試氨酸含量的影響[J].青海師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2005. 6(3) :76-77.驗中Pro在PEG的脅迫下得到很高積累,可以作[16]盧少石,陳斯萍 ,陳斯曼,等.3種暖季型草坪草在干旱條件為脅迫敏感指標。下晡氨酸含最和抗氧化酶活性的變化[J].園藝學(xué)報.2003.30(3):303-306.參考文獻:[17] Hanson A D, Nelon C F.Peersen A R,et al .Capacity for pralineaccumulation during water stres in barley and itso implication for[1] 張燕,方力,李大飛,等.聚乙二醇對煙草種子活力及幼苗breeding for drought reistance[]. 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