嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究

第28卷第3期南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol 28 No. 32005年JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY(Natural Science)嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究蔣字!,邵蔚藍12(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,214036,江蘇,無(wú)錫)(2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,210097,江蘇,南京)[摘要]以乙醇產(chǎn)量和細胞密度的提高為目標,從碳源和氮源人手,對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌Thener ethanolicus JW200的培養基作了初步優(yōu)化以提高乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶的得率,便于提純.葡萄糖濃度的提高對乙醇的產(chǎn)生有明顯的誘導作用,但當葡萄糖濃度高于2%,乙醇產(chǎn)量反而下降.酵母粉對乙醇產(chǎn)量沒(méi)有促進(jìn)作用,單純提高酵母粉濃度對細胞密度無(wú)顯著(zhù)影響,而同時(shí)提高葡萄糖和酵母粉濃度至2.0%,OD6最高可達2.0.2%葡萄糖,0.5%酵母粉對單位細胞乙醇產(chǎn)量的誘導效果最佳.T. ethanolicus JW200粗酶液中未檢測到丙酮酸脫羧酶的活性,經(jīng)親和柱 Cibacron blue3GA部分純化,在NAD洗脫蛋白中檢測到輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶的活性,表明輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶是該菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶,它和乙醇脫氫酶共同作用,將乙酰輔酶A轉化成乙醇.[關(guān)鍵詞]嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌,輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶葡萄糖酵母粉,乙醇[中圖分類(lèi)號]Q939.1,[文獻標識碼]A,[文章編號]0014616(2005)03-006905Primary Study on Ethanol ProductionPathway in Thermoanaerobacter ethanolicusJiang Yu, Shao Weilan, 2(1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology under Ministry of Education, Southern Yangtze Ur214036, Wuxi, China)(2. School of Life Science, Nanjing Normal University, 210097, NanjingAbstract: In order to induce the key enzymes of ethanol production pathway in Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 for purification, the paper optimized the medium to increase the ethanol and cell yields. Fi-nal ethanol production was obviously enhanced when increasing concentration of glucose, but no progresswas detected when glucose reached higher than 2%. No greater ethanol production or cell biomass wasobserved if simply increase concentration of yeast extract. The maximum ODooo reached 2. 0 when increas-ing glucose and yeast extract to 2. 0%. The best ethanol induction medium contained 2. 0% glucose and0. 5% yeast extract. Cell-free extracts were prepared from T, ethanolicus JW200, and no pyruvate decarboxylase activity was detected in it. After partially purified by affinity chromatography Cibacron Blue-3GA, CoA-acylating aldehyde dehydrogenase activity was detected in NAD elution proteins. The resultsdicated CoA-acylating aldehyde dehydrogenase was the key enzyme in ethanol production pathway of T.thanolicus jW200, which convert acetyl-CoA to aldehyde, and then to ethanol by alcohol dehydrogenasKey words: Thermoanaerobacter ethanolicus, CoA-acylating aldehyde dehydrogenase, glucose, yeast ex0引言中國煤化工嗜熱厭氧細菌通常能直接利用一些廉價(jià)的底物如纖維素CNMHG種有很大開(kāi)發(fā)收稿日期:200502-26基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30170511)作者簡(jiǎn)介:蔣宇,女,1978—,博士研究生,主要從事微生物基因工程的學(xué)習與研究.E-mail:biojiangyu@l63.com通明野秀級艙,女,13=教:博土生導師,主零從事微生物分子生物學(xué)的教學(xué)與研究 mail: wIshao( smail. com. c南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第28卷第3期(2005潛力的生產(chǎn)工業(yè)乙醇的微生物隨著(zhù)全球油價(jià)的持續攀升,對嗜熱厭氧細菌乙醇代謝途徑的研究有著(zhù)深遠的經(jīng)濟意義和科學(xué)意義嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 Thermoanaerobacter ethanolicus JW200是從熱泉區分離得到的嗜熱厭氧桿菌,能在37~8℃,pH4.4~9.8范圍生長(cháng),最適生長(cháng)條件是69℃,pH5.8~8.5,是產(chǎn)乙醇能力最強的極端微生物該菌底物范圍廣,能廣泛利用五碳糖和六碳糖,乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、丙酮酸和淀粉,不能利用纖維素當底物濃度小于1%時(shí),以乙醇和CO2為主要發(fā)酵產(chǎn)物12常用的乙醇生產(chǎn)菌的乙醇代謝途徑以釀酒酵母和運動(dòng)發(fā)酵單孢菌為代表,后者通過(guò)丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶將丙酮酸轉化成乙醇.細菌中還存在另外一條乙醇代謝途徑,其中輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶是乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶,比如大腸桿菌.嗜熱細菌中的乙醇代謝途徑以 Clostridium ther-mocellun和 Thermoanaerobacter brock之類(lèi)的細菌為代表,前者只含Ⅰ型乙醇脫氫酶( Primary alcohol dehydrogenase,P-ADH),而后者同時(shí)含Ⅰ型乙醇脫氫酶和Ⅱ型乙醇脫氫酶( Secondary alcohol dehydrogenase,sADH)3,I型乙醇脫氫酶和Ⅱ型乙醇脫氫酶以分別對正醇類(lèi)和異醇類(lèi)的強親和力為區別 Bryant等人80年代初從天然菌株中提純并分析了和Ⅱ型乙醇脫氫酶{6,I型乙醇脫氫酶已被克隆本文從碳源和氮源入手,以乙醇產(chǎn)量和細胞密度的提高為目標對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌做了初步培養基優(yōu)化以提高乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶的得率,便于提純;并分析了嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶,初步擬定了該菌的乙醇代謝途徑1材料和方法1菌株嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 Thermoanaerobacter ethanolicus JW200(ATCC31550)由美國佐治亞大學(xué)微生物系J. Wiegel實(shí)驗室惠贈1.2主要試劑乙酰輔酶A、NAD、NADH購自 Roche公司;二硫蘇糖醇、疊氮鈉、乙醇脫氫酶ADH、半胱氨酸鹽酸鹽、所有維生素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;親和柱填料 Cibacron Blue-3GA、刃天青購自 Sigma公司1.3培養基和培養條件嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌基本培養基配方(ATCC1190):0.15%KH2PO4;0.42%Na2HPO4·12H2O;0.05%NH4Cl;0.05%(NH4)SO4;0.018%MgCl2·6H2O;0.2%酵母粉( Oxoid);0.8%葡萄糖;0.5mLL維生素溶液;5mL/ L Wolfe' s Modified Mineral Elixir;lmLL0.1% Resazurin;40/L還原劑還原劑配方:NaOH(0.2moL)200mL;Na2S9H22.5g; Cysteine HC.…H2025 g NaOH煮沸同時(shí)充N(xiāo)2,稍冷卻加Na2S和 Cysteine,密封后高壓滅菌,12l℃,20min培養基煮沸充氮排氧,稍冷卻加還原劑,分裝預先充氮的厭氧菌培養管或血清瓶,密封滅菌用無(wú)菌注射器按1%接種在厭氧菌培養管活化-70℃保藏菌種,69℃靜置培養.1.4細胞密度培養過(guò)程中用注射器取樣,用分光光度計在600mm處讀數為排除氧指示劑的讀數干擾,操作熟練后培養基里可以不加刃天青指示劑1.5乙醇產(chǎn)量測定培養基中乙醇濃度的測定采用氣相色譜法,安捷倫1490氣相色譜儀,d3×1不銹鋼柱,滬產(chǎn)401有機擔體(規格CC60~80目),載氣:氮氣,柱溫140℃,檢測器溫度200℃,進(jìn)樣溫度200℃1.6培養基的部分優(yōu)化中國煤化工1.6.1糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響在基本培養基中依次加入葡萄糖至終濃度0.8%,1,0LCNMHG,,2,8%,平行培養40h,分別在20h,30h,40h取樣測定細胞密度,并測定培養40h培養基乙醇終濃度1.6.2碳源和有機氪源對乙醇產(chǎn)量的影響為研究基本培養基中的葡萄糖和酵母粉的含量和比例對乙醇產(chǎn)量的影響,分4組實(shí)驗:1%葡萄糖萬(wàn)劑數據蔣宇,等:嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究0.5%酵母粉;1%葡萄糖,2%酵母粉;2%葡萄糖,0.5%酵母粉;2%葡萄糖,2%酵母粉.平行培養40h,分別在20h,30h,40h取樣測定細胞密度,并測定培養40h培養基乙醇終濃度1.7嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養在不含還原劑和葡萄糖的優(yōu)化培養基里加2.5%的瓊脂粉,121℃,40min高壓滅菌后在厭氧工作臺( Shellac公司)里加無(wú)菌還原劑和葡萄糖,待指示劑顏色退去后分裝預先滅菌的厭氧管每管4mL和厭氧瓶,凝固后密封4℃保存鋪平板前將活化后的菌液和厭氧管中融化的4mL培養基在厭氧臺里混勻,均勻地平鋪在預先鋪好底層培養基的厭氧瓶里,65℃倒置培養48h.1.8柱層析和乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的酶活測定1.8.1丙酮酸脫羧酶的測定細胞培養至對數生長(cháng)后期至平衡期冰浴停止培養,4℃,8000r/min,10min離心收集細胞.dH2O洗滌細胞2次,用20mmol/ L Tris- HCI pH8.0, 1 mmol/LDT,o.02%NaN3重懸細胞高壓細胞破碎儀破碎細胞,1,2×103kPa,2次.粗酶液14000r/min,4℃,離心1h,取上清用緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCIpH8. 0, 150 mmol/L NaCl, I mmol/L DTT, 0. 02% NaN, )iti.酶活測定標準步驟:2mL緩沖液含25 mmol/L MOPS(pH6.5),1mmo/L焦磷酸硫胺素,1,5mmol/LMgCl2,1 mmoL/L NADH;加透析后粗酶液40μL,50℃,平衡30mn;加底物內酮酸鈉至終濃6mmo/L,50℃,反應30min;冰浴迅速中止反應,補加NADH3mmo/L,分裝兩個(gè)比色杯各1m,一份加入乙醇脫氫酶(300U/mg)ADH3U/mL,另一份加入等體積ddH2O為空白對照,室溫反應30min;分光光度計340mm處讀數,計算相對于空白對照的下降值.以1μmol/min還原NADH為一個(gè)酶活單位以運動(dòng)發(fā)酵單孢菌丙酮酸脫羧酶的大腸杄菌重組菌粗酶液作陽(yáng)性對照,酶活測定步驟同上1.8.2親和層析親和柱填料 Cibacron blue3GA用去離子水溶漲過(guò)夜后裝柱,用緩沖液A平衡8~10個(gè)柱體積透析后粗酶液上柱,0.5mL/min,緩沖液A洗滌8~10個(gè)柱體積將未結合的蛋白徹底洗盡,在2個(gè)柱體積緩沖液A中加入4mmo/L的NAD洗脫.親和柱可用2 mol/L NaCl清洗并保存1.8.3輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶的測定親和柱NAD洗脫蛋白70%硫酸胺沉淀,后用20mmo/ L Tris-HCl(pH7.5),1mmo/L二硫蘇糖醇,0.02%疊氮鈉,20%甘油透析;-20℃冰凍保存.酶活測定標準體系:1mL標準體系含50mmo/ L Tris-HCl(pH8.0),0.5 mmOl/L NADH,5mmo/L二硫蘇糖醇,0.5mmol/L乙酰輔酶A,親和柱NAD洗脫蛋白100μ,60℃反應30min,冰浴終止反應,分光光度計340mm處讀數,計算相對于空白對照的下降值空白對照加等體積的dH12O代替底物乙酰輔酶A以1μmol/min的速率還原NADH為一個(gè)酶活單位2結果2.1糖濃度對細胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響根據預實(shí)驗,在基本培養基中加入葡萄糖至終濃1%和3%,平行培養,分別在20h,30h,40h,50h取樣測定細胞密度和培養基乙醇含量,確定代謝產(chǎn)物乙醇累積至平衡的最短培養時(shí)間為40h,故確定優(yōu)化實(shí)驗的培養時(shí)間為40h.如圖1所示,糖濃度的增加對乙醇產(chǎn)量的提高有明顯的誘。06導作用,但對細胞密度基本沒(méi)有影響當葡萄糖濃度是2%時(shí)乙醇產(chǎn)量最高當葡萄糖濃度繼續增高,乙醇產(chǎn)量又開(kāi)始回落中國煤化工2.2碳源和有機氮源對細胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響CNMHG如圖2所示,合適的碳氮比對細胞密度有很大的影響以11%葡萄糖為碳源,單純的將酵母粉從0.5%提高到2%,并沒(méi)葡萄糖濃度%有提高細胞密度,可能是由于碳氮比的失調造成的;同樣對乙圖1糖濃度對細胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響醇產(chǎn)量的提高也沒(méi)有貢獻,因此酵母粉不能誘導乙醇的產(chǎn)生細胞密度,→—乙醇濃度南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第28卷第3期(2005年)而單純提高糖濃,也不會(huì )提高細胞密度,但能誘導乙醇的產(chǎn)生同時(shí)提高葡萄糖和酵母粉的濃度,能大幅提高細胞密度,培養基乙醇的終濃也達到最高,而從圖3可以看出這部分的乙醇是由于細胞密度的提高而貢獻的.以乙醇產(chǎn)量除以最高細胞密度作為縱坐標,也就是將每個(gè)細胞的產(chǎn)乙醇量進(jìn)行比較,2%葡萄糖0.5%酵母粉能達到乙醇產(chǎn)量的最佳誘導效果N果行口細胞密度,■乙醇濃度1.0%葡萄糖,05%酵母粉1.10%葡萄糖,0.5%酵母粉2.1.0%葡萄糖,2.0%酵母粉2.1.%葡萄糖,2.0%酵母粉3.20%葡萄糖,0.5%酵母粉3.20%葡萄糖,0.5%酵母粉4.2.0%葡萄糖,2.0%酵母粉4.2.0%葡萄糖,2.0%酵母粉圖2葡萄糖和酵母粉濃度對細胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響圖3葡萄糖和酵母粉濃度對單位細胞乙醇產(chǎn)量的影響2.3嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養根據培養基優(yōu)化的結果,%葡萄糖,2%酵母粉最有利于細胞生長(cháng),故采用此培養基作固體培養.采用雙層培養法可有效避免因高溫下培養基表面脫水嚴重導致的表面菌落生長(cháng)不穩定,也可避免冷凝水對表面菌落生長(cháng)的干擾,能獲得穩定的單菌落.36h即可看到透明的單菌落(圖4),培養基表面菌落較淺表層菌落生長(cháng)快速,菌落直徑最大可達1.5mm2.4乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的酶活檢測圖4嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養由于粗酶液中蛋白種類(lèi)很多,且含部分不能用透析去除的細胞破碎液中的天然底物,有關(guān)NADNADH氧化還原的酶對酶活測定有干擾,所以先用NADH平衡至本身的天然底物耗盡后,再加底物丙酮酸并補加NADH,高溫下反應;由于購買(mǎi)的ADH是常溫酶,故加ADH后的第二步反應在常溫下進(jìn)行,空白對照不加ADH,加等體積的ddH2O.我們在粗酶液中未檢測到丙酮酸脫羧酶的活性,而同時(shí)我們能測到陽(yáng)性對照運動(dòng)發(fā)酵單孢菌的丙酮酸脫羧酶的酶活為0.36U/mg.由此證明嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌中不存在丙酮酸脫羧酶我們嘗試直接用粗酶液測定乙醛脫氫酶的酶活未成功,因為受到其它有關(guān)NAD/NADH氧化還原的酶的干擾 Cibacron blue-3GA是一種以染料為配基的填料,能結合核酸輔助因子、脫氫酶、激酶、限制性?xún)惹忻?、白蛋白、干擾素等.用NAD能特異性洗脫所有以NAD/NADH作為輔酶的蛋白.根據這個(gè)原理,乙醛脫氫酶能被結合,且能被NAD洗脫,我們在NAD洗脫蛋白中檢測到乙醛脫氫酶的酶活為0.23U/mg,由此可見(jiàn)乙醛脫氫酶是該菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶.3討論嗜熱厭氧桿菌是產(chǎn)乙醇能力最強的極端微生物,它的乙醇代謝途徑是不同于常用的乙醇生產(chǎn)菌,如釀酒酵母和運動(dòng)發(fā)酵單孢菌.常溫細菌,以運動(dòng)發(fā)酵單孢菌為中國煤化工酶是乙醉代謝途徑中的關(guān)鍵酶,它們能將丙酮酸直接轉化成乙醛,再轉化成丙酮酸脫羧酶.因此,熱穩定性的丙酮酸脫羧酶仍然是現今CNMHG嗜熱菌中發(fā)現過(guò)1元杰點(diǎn),諧體文的實(shí)驗結果和Bryant等人的硏究結果36,我們可以推測嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的乙醇代謝途徑的關(guān)鍵酶是輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶,它們能將乙酰輔酶A轉化成乙醛,再生成乙醇.這條途徑也是嗜熱細菌乙醇代謝的典型途徑.萬(wàn)疝數據蔣宇,等:嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究由于無(wú)法在培養過(guò)程中利用粗酶液直接跟蹤乙醛脫氫酶的酶活,我們以乙醇終產(chǎn)量和細胞密度的提高為目標對培養基進(jìn)行初步優(yōu)化,以確定高乙醇產(chǎn)量的誘導條件,進(jìn)而提高乙醇代謝途徑中的一系列關(guān)鍵酶的得率,便于提純結果表明,高糖對乙醇的產(chǎn)生有明顯的誘導作用,但高于2%乙醇產(chǎn)量又開(kāi)始回落,可能此時(shí)代謝主要轉向有機酸的產(chǎn)生酵母粉對乙醇的產(chǎn)生沒(méi)有促進(jìn)作用,但對細胞密度的提高有明顯作用據報道,酵母粉對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的生長(cháng)有著(zhù)不可替代的作用2.丙酮酸脫羧酶的酶活是用間接測定下一步乙醇脫氫酶的活性來(lái)測定的,而乙醇脫氫酶和輔酶A依賴(lài)型乙醛脫氫酶的酶活的測定又是介于NAD/NADH的氧化還原,故受到其它和 NAD/NADH相關(guān)酶的干擾,因此,在粗酶液中直接測定丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶的活性比較困難.本文用親和柱部分純化粗酶液進(jìn)行酶活測定獲得成功.本文的硏究結果為對其進(jìn)行進(jìn)一步深入研究奠定了基礎.[參考文獻][1 Lovitt R W, ShenG J, Zeikus J G. 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