乙醇對肌肉衛星細胞myogenin表達的影響

東南大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)674J Southeast Univ( Med sci edi) 2012, Dec; 31(6): 674-680論著(zhù)乙醇對肌肉衛星細胞 myogenIn表達的影響沈干,吳京2, Gordon huggins(1.南京醫科大學(xué)第二附院東院整復外科,江蘇南京210003:2. New England medical centerTufts University, Massachusetts Boston 02115)摘要]目的:探討慢性酒精中毒過(guò)程中乙醇對肌肉衛星細胞 myogen表達的影響及其在酒精性肌肉損傷中的作用。方法:(1)體外實(shí)驗:取 Sprag- Dowley大鼠,原代培養大鼠肌肉衛星細胞,設實(shí)驗鉏(乙醇作用組)與對照組(正常培養液對照組),培養細胞至80%融合時(shí),更換為分化培養液,對實(shí)驗組與對照組衛星細胞形成的肌管計數,并觀(guān)察衛星細胞 MyogeniN的表達。(2)動(dòng)物實(shí)驗:予小鼠廴醇飲食(個(gè)月)制造乙醇中毒動(dòng)物模型,在損傷后肢肌肉后第27天取組織切片觀(guān)察損傷部位肌肉衛星細胞増殖及新肌柬形成情況。結果:實(shí)驗組肌管計數及衛星細胞 myogenIn的表達均低于對照組(P<0.05),但乙醇飲食小鼠損傷肌肉標本中衛星細胞及新肌東數量與正常飲食小鼠差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。結論:乙醇可以通過(guò)降低肌肉衛星細胞的 myogenin表達抑制其肌性分化,減少衛星細胞形成肌管的數量關(guān)鍵詞]肌肉;衛星細胞;乙醇; myogenIn;分化中圖分類(lèi)號]R685.2文獻標識碼]A[文章編號]1671-6264(2012)06-0674-07doi:10.3969/j.issn.1671-6264.2012.06.003Effect of ethanol to myogenin expression in muscular satellite cellSHEN Gan', WU Jing, Gordon Huggins(1. Department of Plastic and Reconstructive Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanjing MedicalUniversity, Nanjing 210003, China 2. New England Medical Center, Tufts University, Boston02115,USA)L Abstract] Objective: To investigate the effect of ethanol to myogenin expression in muscular satellite cells and it'srole in alcoholic muscle atrophy. Methods: 1 )In vitro study, Sprage-Dowley rats were used, satellite cells wereharvested and cultured from rat muscle, experimental group( ethanol culture medium )and control group( normalculture medium )were set. When cells became 80% confluent, growth culture medium was changed into differentiationmedium. To evaluate the effect of ethanol, myotube quantitation and Western Blot for myogenin expression wereperformed.( 2 )In animal study, animal model of alcoholism was made by alcoholic diet( 1 month ) then muscle ofposterior limb was harmed, the proliferation of satellite cells and formation of new muscle bundles were evaluated byhistological section. Results: The number of myotubes and expression of myogenin in experimental group were lessthan control group; but there was no significant difference on numbers of satellite cells and new muscle bundlesbetween two groups in animal model of alcoholism. Conclusion: Ethanol can inhibite differentiation of satellitecreasing of myogI Key words muscle; satellite cells; ethanol; myogenin; differentiation肌肉衛星細胞位于骨骼肌纖維的肌細胞膜與基底膜之間,具有自我更新的能力,又被稱(chēng)為肌肉干細胞「收稿日期]2012-06-01修回日期]2012-06-15沈干,等.乙醇對肌肉衛星細胞 myogenIn表達的影響675在肌肉形成以及肌肉損傷修復中扮演重要作用。慢性中貼壁培養,每2日換液Ⅰ次,待細胞接近80%融合酒精中毒可引起肌肉萎縮,甚至引起酒精性心臟病。時(shí)進(jìn)行實(shí)驗。本硏究中作者對慢性酒精中毒過(guò)程中乙醇是否通過(guò)損1.2.3衛星細胞向肌肉誘導分化將衛星細胞培養害衛星細胞而引起酒精性肌肉萎縮、降低衛星細胞修液置換為誘導分化液(DMEM+2%馬血清),實(shí)驗組分復損傷肌肉的能力作一探討?；囵B液中另加0.01%~1%的乙醇,分化培養1周1資料和方法觀(guān)察兩組衛星細胞形成肌管( myotube)的數量。由非本實(shí)驗參與人員隨機選擇不同培養時(shí)間培養皿中至少1.1實(shí)驗動(dòng)物及分組3個(gè)光鏡下視野(×10),計算肌管的數量,并進(jìn)行統計日齡2~3 d sprag- Dowley(SD)大鼠及FVB成年學(xué)處理。小鼠來(lái)自查爾斯河實(shí)驗室(美國,波士頓)。(1)體外1.2.4衛星細胞形成肌管的檢測鑒定細胞及肌管實(shí)驗分組:獲取大鼠肌肉衛星細胞后實(shí)驗分實(shí)驗組以多聚甲醛在-20℃下固定1min,然后由PBS漂洗2乙醇作用組)及對照組(正常培養液對照組)。衛星次;以10%馬血清封阻1h,然后加入一抗 myogenIn及細胞生長(cháng)培養2d后更換為誘導分化液(DMEM+2%肌肉重鏈蛋白MHC(1:200小鼠單克隆抗體, Sigma公馬血清)誘導分化1周。實(shí)驗組生長(cháng)培養液及分化液司產(chǎn)品)作用半小時(shí)后,以PBS漂洗2次,加入二抗中加入1%的乙醇,共作用9d。對照組衛星細胞培養(抗小鼠二抗連接免疫熒光C3, Sigma公司產(chǎn)品),作不加乙醇。(2)動(dòng)物實(shí)驗分組:FVB成年雄性小鼠,用半小時(shí)后,以PBS漂洗2次。細胞核以DAPI染色。體重20~30g,隨機分為兩組,每組10只。實(shí)驗組給最后熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照。予乙醇飲食1個(gè)月;對照組給予正常飲食。然后檢測1.2.5 Western blot檢測乙醇對衛星細胞 myogenin表肌肉損傷后再生情況。達的影響于加入誘導液之前(0d)及誘導后的第1、1.2試劑及方法3、5、7d采取標本,按 PIERCE公司Ec- Western blot試1.2.1試劑胰蛋白酶( Sigma),Ⅱ型膠原酶(美國,劑盒操作說(shuō)明書(shū)作 Western blot蛋白檢測。衛星細胞wort- hington),F10培養液、胎牛血清(FBS)、DME及肌管裂解,蛋白電泳,轉膜,滴加n(1:200)培養液、馬血清均為Gibc公司產(chǎn)品。ADS緩沖液由抗體,Iumi- Phos WB化學(xué)熒光素底物標記,暗房X光Gorden huggins實(shí)驗室提供。80μm尼龍網(wǎng)( Becton,片曝光。內參照為 GAPDHDickinson and Company,美國),10m/2(C3H)細胞系由1.2.6乙醇對101/2(C3H)細胞系的myo質(zhì)粒影Gorden huggins實(shí)驗室提供,myo質(zhì)粒由 Gorden響小鼠胚胎間充質(zhì)干細胞101/2(C3H)細胞系轉Huggins實(shí)驗室提供,鼠乙醇飼料(Dyes#710260,美染myoD質(zhì)粒。6孔板培養10T1/2細胞,細胞數量為國),鼠對照正常飼料( Dyets,#10027,美國)。4×103,待細胞80%融合后,按照 PolyfectAMINE使用1.2.2肌肉衛星細胞獲取將SD大鼠斷頸處死,以指南進(jìn)行操作,轉染myoD質(zhì)粒。培養2d后,更換為75%酒精消毒皮膚,取后腿肌肉,冷PBS沖洗數次,以含馬血清的分化培養液,作用2d后收取細胞, Western銳利眼科剪反復剪切肌肉組織,直至肌肉呈肉糜狀。Blωt檢測乙醇對1OT/2(C3H)細胞myoD質(zhì)粒的表達加入終濃度為100U·ml1Ⅱ型膠原酶及0.4mg·及 myogenIn表達的影響。胰酶消化酶溶液,置入37℃水浴箱中,每15~1.2.7動(dòng)物實(shí)驗予FVB小鼠乙醇飲食1個(gè)月,對20min振蕩1次,消化30~45min,吸取消化液與細胞照組予正常飲食。然后制造鼠后肢肌肉損傷模型。具的混懸液,由80μm的尼龍濾網(wǎng)濾去肌腱等組織碎體操作如下:常規消毒,切開(kāi)皮膚,分離后肢脛前肌,以片,對未消化的肌肉組織可加入0.05%胰酶,37℃水蚊式鉗橫行夾斷肌肉,同時(shí)將BU藥片植入小鼠皮浴箱中再消化20min,不斷搖晃直至大部分肌肉組織下,在損傷后的第2天和第7天取肌肉標本,固定后切被消化。同樣以80μm的尼龍濾網(wǎng)濾去未消化的組片,BNU染色。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察肌束及BnU染色織碎片陽(yáng)性的衛星細胞,計數并拍照細胞混懸液離心5min(1200r·min1),棄去上1.3統計學(xué)處理清液,加入肌肉衛星細胞培養液(F10培養液+20%實(shí)驗數據應用SPSS13.0統計軟件處理,實(shí)驗組FBS),移入由Ⅳ型膠原預先處理的10cm的培養皿,與對照組兩組數據均釆用方差分析。置人37℃5%CO,培養箱,靜置30~40min,然后吸取細胞混懸液,重新移入由Ⅳ型膠原預先處理的10cm的2結果培養皿,再次進(jìn)行預貼壁,使混雜在衛星細胞中的成纖2.1大鼠原代衛星細胞培養676東南大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)2012年12月,31(6)壁速度較慢,仍處于懸浮狀態(tài)。經(jīng)反復預貼壁后,肌肉2.2肌肉衛星細胞形成肌管的鑒定細胞消化懸浮液中成纖維細胞含量大大減少;靜置貼肌管免疫細胞化學(xué) myogenin及肌肉重鏈蛋白壁的為肌肉衛星細胞,體積較成纖維細胞小,當增殖速(MHC)反應陽(yáng)性,其中 myogenin表達在細胞核,可見(jiàn)度快,培養密度較大時(shí),容易發(fā)生細胞融合,形成肌管;多個(gè)細胞核排列在肌管中;而MHC表達在細胞漿中將培養液更換為含2%馬血清的分化培養液后肌管形(圖2)。成更充分(圖1)。2.3肌管計數、衛星細胞數量和形態(tài)隨機計數,可見(jiàn)實(shí)驗組肌管數量(圖3)較對照組少,經(jīng)統計差異有統計學(xué)意義(P<0.05)。 myogenIn染色顯示衛星細胞的數量和形態(tài)在誘導之前兩組無(wú)差異(圖4);在誘導分化第7天,兩組的肌管計數的差異有統計學(xué)意義(圖5)。24 Western blot檢測乙醇對衛星細胞 myogenin表達的影響在細胞培養的不同時(shí)間點(diǎn)( Days Culture),經(jīng)乙醇作用衛星細胞 myogenIn表達逐漸減少(圖7)。雖然圖1肌肉衛星細胞分化培養液誘導下形成的肌管×100對照組 myogenIn表達也逐漸減少,但是實(shí)驗組Fig1 Myotubes formed by muscle satellite cells which induced" myogenin表達下降更快,在誘導后第7天已幾乎檢測不到by differential medium x 100Alexa 544DA門(mén)MereeMHCA.肌管內多細胞核對 myogenin熒光反應陽(yáng)性;B.細胞核DAP染色;C.兩圖重疊;D.肌管MHC免疫熒光反應陽(yáng)性;E.DAP染色(下中);F.兩圖重疊圖2肌管免疫細胞化學(xué)檢測A Nuclei of muscle cells are positive for myogenin: B. Staining of DAPl: C. merging of two picturD Myotube is positive for MHC; E Staining of DAPI( lower middle ) F. merging of two pictures沈干,等.乙醇對肌肉衛星細胞 myogenIn表達的影響677一對照糾同樣以 Western blot檢測細胞myoD及 myogeNin表達實(shí)驗組(圖8),而mvoD表達實(shí)驗組與對照組之間無(wú)顯著(zhù)性彩江一←胂差異,但實(shí)驗組 myogenin明顯表達下降。2.6肌肉損傷后新肌束形成及衛星細胞的變化實(shí)驗組在乙醇飲食1個(gè)月后,取小鼠后肢未損傷的肌肉切片,光鏡下觀(guān)察可見(jiàn)肌東邊衛星細胞數量相對較對照組少(圖9),但差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)。小6鼠肌肉損傷后2d,損傷部位切片可見(jiàn)肌束斷裂,衛星圖3肌管計數細胞數量大量增加,新生衛星細胞容易結合BrlUBrdU染色呈現陽(yáng)性。但是對照組與實(shí)驗組細胞數量Fig 3 Myotubes quantitation差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05X圖10)。2.510T1/2(C3H)轉染myoD質(zhì)粒后myo及在后肢損傷后7d,對照組與實(shí)驗組損傷部位的肌肉切片,可見(jiàn)許多新形成的肌束,肌束內成串的細胞myogenIn表達核,與體外衛星細胞融合的狀態(tài)相同(圖11)。細胞系10T2(C3H)轉染myoD質(zhì)粒后,誘導2d圖4誘導分化前對照組(A)與實(shí)驗組(B)細胞 myogenIn熒光染色Fig 4 Before differentiation, myogenin staining for cells in control group( A )and exprimental group( B圖5誘導分化1周對照組(A)與實(shí)驗組( B)myogenin熒光染色Fig 5 Myogenin staining for myotube after cultured in differentiation medium for 1 week, control group( A )and experimental678東南大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)2012年12月,31(6)圖6誘導分化1周對照組(A)與實(shí)驗組B)MHC熒光染色Fig 6 MHC staining for myotube of control group( A )and experimental group( B )after cultured in differentiation medium for 1week0GAPDH圖7 Western Blot顯示不同時(shí)間點(diǎn)(0-7d)實(shí)驗組(a)與對照組( b)myogenin表達的變化, GAPDH為內參照Fig 7 Western Blot showed expression of myogenin in experimental group( a )and control group( b )in different timepoints( 1-7 daysmyoDGAPDH圖8細胞系10m12C3H)轉染moD后,誘導2d后, Western圖9對照組A)與實(shí)驗組(B)未損傷的肌肉切片,肌束邊可Blot顯示實(shí)驗組a)及對照組 b)myoD及 myogenin表達見(jiàn)衛星細胞附著(zhù)HE×10Fig 8 MyoD was transfected into 10T1/2( C3H ) then culturedFig 9 Section of uninjured muscle in control group( A)andedium, Western Blot showed myod and experimental group B ), satellite cells were beside of myotubesmyogenin expression in ethanol group a and control group bHE×100沈干,等.乙醇對肌肉衛星細胞 myogenIn表達的影響679圖10對照組(A)與實(shí)驗組(B)損傷第2天的肌肉切片HE×100Fig 10 Section of injuried muscle( Day 2 )in control group( A )and experimental group( B ), the broken myotubes and increasednumber of satellite cells were shown HE x 100△圖11對照組(A)與實(shí)驗組B)損傷第7天的肌肉切片HE×200Fig 11 Section of injuried muscle( Day 7)in control group( A )and experimental group( B ) many myotubes were newly formedand many neuclei were arranged in chain HE X 2003討論肌肉衛星細胞只存在于骨骼肌內,心肌和平滑肌內沒(méi)有衛星細胞。隨著(zhù)年齡的增加,衛星細胞的密度長(cháng)期酒精攝入是骨骼肌和心肌萎縮的主要原因。逐漸減少,到一定程度后,終身維持。在出生后一段時(shí)乙醇或其代謝產(chǎn)物對細胞均有毒性作用:乙醇脫氫酶間內,衛星細胞核的比例明顯下降,這主要是因為隨著(zhù)可使乳酸產(chǎn)生,改變細胞的代謝;乙醇可以使線(xiàn)粒體膨衛星細胞的融合,而肌細胞核總數增加23。所以我大,脆性增加,引起線(xiàn)粒體的損害。本實(shí)驗目的是探索們采用岀生2~3d的大鼠,其肌肉組織中富含肌肉衛乙醇是否可通過(guò)損害肌肉衛星細胞而引起肌肉的萎縮星細胞。我們也曾以單肌纖維貼壁方法4培養出衛和損傷,或者影響肌肉損傷的修復。星細胞(結果未顯示),但由于技術(shù)要求較高,衛星細肌肉衛星細胞又被稱(chēng)為肌肉干細胞,位于骨骼肌胞的產(chǎn)量有限。所以在需要大量衛星細胞的實(shí)驗中我纖維的肌細胞膜與基底膜之間,其核較大、胞漿少,細們采用幼鼠肉糜消化法。胞器數量少。在損傷等情況下,衛星細胞被激活,分裂肌源性決定因子(MDF)在肌細胞分化中均發(fā)揮關(guān)增殖,參與肌肉的修復。鍵作用,這些因子包括My5、Myf6、 myogenin和myoD肌肉衛星細胞具有自我更新的能力,以維持其數而 myogenIn是由Myf5和myoD激活的。在分子水平,量的大體穩定。肌肉衛星細胞的自我更新通過(guò)兩種機靜止期肌肉衛星細胞被激活的特征是Myf5和myoD的制:一是由非對稱(chēng)性分裂所造成的,大部分的子細胞定迅速上調。myoD在12h內最早表達上調,隨后出現型于肌源性分化,而另一部分的子細胞重新成為衛星Myf及myoD的協(xié)同表達,而 myogenin及MHC是肌肉細胞閣;二是肌肉衛星細胞進(jìn)行對稱(chēng)性分裂,其中一個(gè)分化晚期表達的蛋白56。剛從肌纖維分離出的衛星細激活衛星細胞可以退出細胞循環(huán),重新進(jìn)人靜止狀態(tài),胞并不表達肌源性標志物Myf5和myoD,提示靜止期衛680東南大學(xué)學(xué)報(醫學(xué)版)2012年12月,31(6)本研究發(fā)現,乙醇對衛星細胞 myogenIn表達有顯著(zhù)影響,而對myoD影響不顯著(zhù)。說(shuō)明其作用的位點(diǎn)[參考文獻在肌肉發(fā)育的較遲階段,使衛星細胞形成肌管數量較1] CONBOY I M, RANDOT A, The regulation of Notch signalin對照組少。在 Western blot檢測中兩組 myogenin表達controls satellite cell activation and cell fate determination in也有差異。我們以myoD質(zhì)粒轉染細胞系10T1/2postnatal myogenesis J]. Dev Cell, 2002, 3(3): 397-409(C3H)細胞,誘導細胞向肌細胞分化,并同樣以乙醇2 GIBSON M O, SCHULTZ E. The distribution of satellite cells處理,也發(fā)現乙醇在作用2d后使 myogenin表達下降,and their relationship to specific fiber types in soleus and ex-tensor digitorum longus muscles J]. Anat Rec, 1982, 202(3)而對mvoD表達影響不大。329-337乙醇會(huì )對身體帶來(lái)多方面的影響,甚至可以影[31 GIBSON M C, SCHULTZ F. Age-related differences inabsolute響人間充質(zhì)干細胞的分化9。本實(shí)驗也證實(shí)了乙醇numbers of skeletal muscle satellite cells[ J]. Muscle Nerve對肌肉干細胞的負面影響。為進(jìn)一步驗證乙醇對在體983,6(8):574-580肌肉的影響,我們給予實(shí)驗動(dòng)物乙醇飲食,并且在乙醇4 ROSENBLATT D J, LUNT A, PARRY D J,etal. Culturing of飲食后1個(gè)月后制造肌肉損傷模型。而且處于增殖和satellite cells from living single muscle fibers explants[ J ]. In分裂的細胞對BrdU染色顯示陽(yáng)性,肌肉的衛星細胞Vitro Cell Dev Biol Anim. 1995.3I(10):773-779在肌肉損傷的情況下能夠被激活。在肌肉損傷后2d,[5 COOPER R N, TAJBAKHAH S, MOULY V, et al. In tito satel通過(guò)組織切片,我們發(fā)現衛星細胞數量大大增加;在損lite cell activation via Myf5 and MyoD in regeneration mouse傷后7d,這些衛星細胞融合形成新的肌束,肌束內細skeletal muscle J]. J Cell Sci. 1999. 112( Pt 17): 2895-2901[6] WEI Q. PATERSON B M. Regulation of MyoD function in the胞核排列成串,與體外衛星細胞融合的表現一樣。但dividing myoblast J ]. FEBS Lett, 2001, 490(3): 171-178可能由于動(dòng)物乙醇飲食的時(shí)間較短,沒(méi)有完全體現乙[7] YABLONKA R Z, RUDNICKI M A, RIVERA A J,etal.The醇的慢性中毒損傷,所以實(shí)驗組與對照組在衛星細胞transition from prolife數量以及形成的新肌束數量上差異無(wú)統計學(xué)意義。ellite cells from mice lacking MyoDL J J. Dev Biol, 1999, 210我們也對損傷肌肉進(jìn)行了PCR等方法檢測損傷肌肉(2):440-455yogenIn表達(結果未顯示),亦未得到兩組有顯著(zhù)差8】HPJA,HPJD, ATALA A,etal, Ethanol alters the oste異的結果。在將來(lái)進(jìn)一步的實(shí)驗中,我們將延長(cháng)乙醇genic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells[ J飲食的時(shí)間,真正模擬慢性乙醇中毒的情形。Alcohol Clin Exp Res, 2010, 34( 10): 1714-1722本實(shí)驗首次通過(guò)對衛星細胞的培養來(lái)驗證乙醇對[9] GONG Z, WEZEMAN F H. Inhibitory effect of alcohol on osteogenic differentiation in human bone marrow- derived mesen其向肌肉分化的影響,結果顯示乙醇可使衛星細胞chymal stem cells[ J ] Alcohol Clin Exp Res, 2004, 28(3myogenIn表達下降,從而抑制其肌性分化。468-479《現代醫學(xué)》簡(jiǎn)介《現代醫學(xué)》是由教育部主管、東南大學(xué)主辦的國家級核心期刊,1964年創(chuàng )刊,現已出版發(fā)行40卷。2013年由雙月刊改為月刊?！冬F代醫學(xué)》為中國科技論文統計源期刊,即中國科技核心期刊,多年來(lái),《現代醫學(xué)》一直被《中國核心期刊遴選)數據庫》《中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價(jià)數據庫》《中國科學(xué)引文數據庫》、《中國期刊網(wǎng)》、《中國學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)》《中文科技期刊數據庫》、《資源系統》、《天元數據網(wǎng)》、《龍源期刊網(wǎng)》《中國教育閱讀網(wǎng)》全文收錄,同時(shí)被《中國醫學(xué)文摘》、《中國藥學(xué)文摘》各分冊收錄。從2011年3月開(kāi)始和中國學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)電子雜志社正式簽署了獨家數字出版合作協(xié)議?！冬F代醫學(xué)》面向國內外公開(kāi)發(fā)行,國際標準刊號:ISSN1671-7562、國內統一刊號:CN32-1659/R。其以中高級衛生工作者為主要讀者對象,主要報道醫療衛生工作者在臨床醫學(xué)、預防醫學(xué)、影像醫學(xué)等方面的先進(jìn)經(jīng)驗、科研成果以及與實(shí)踐密切結合的基礎醫學(xué)硏究。設有專(zhuān)家論壇、論著(zhù)、經(jīng)驗交流、臨床病例討論、綜述、個(gè)案報道診誤治、中醫中藥、護理等欄目。自2009年起現代醫學(xué)啟用網(wǎng)上投稿系統(網(wǎng)址htp:/ww.xdyx.org,cn),作者可登陸后注冊投稿,并跟蹤稿件狀態(tài)。