巰基乙醇對黃粉蟲(chóng)NAGase活力的影響

第24卷第4期泉州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué))VoL 24 No 42006 F 7 a Journal of Quanzhou Normal University(Natural Science) Jul 2006巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase活力的影響謝曉蘭,潘小芳,劉小強(泉州師范學(xué)院化生學(xué)院,福建泉州362000摘要:以黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)為材料,采用0.05mol/LpH7.5 Tris-HCl緩沖液抽提、硫酸銨分級分離提取N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( NAGase, EC3.2.1.52),獲得比活力1025u/mg的酶制劑,研究 NAGase催化 PNP-NAG水解反應的動(dòng)力學(xué)參數測得米氏常數K=0.384mmo/L,探討巰基乙醇對該酶活力的影響.結果表明巰基乙醇對該酶活力具有顯著(zhù)的抑制作用,其抑制作用顯示可逆過(guò)程研究巰基乙醇對該酶的抑制類(lèi)型顯示其抑制效應為混合型,K1和KB分別為1.9%和9.6%關(guān)鍵詞:黃粉蟲(chóng);N-乙酰PD·氨基葡萄糖苷酶;巰基乙醇;抑制作用中圖分類(lèi)號:Q556.1文獻標識碼:A文章編號:1009-8224(2006)04-0101-05幾丁質(zhì)酶系是由內切幾丁質(zhì)酶外切幾丁質(zhì)酶和N乙酰BD氨基葡萄糖苷酶( NAGaseEC321.52)等3種不同組分組成的(,它們協(xié)同作用將多聚殼聚糖分解產(chǎn)生N乙酰BD氨基葡萄糖,該酶的降解產(chǎn)物在生命科學(xué)醫學(xué)、化工、農業(yè)及環(huán)境科學(xué)等方面潛在的應用價(jià)值已受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注N乙酰BD氨基葡萄糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中,在抗菌防御,幾丁質(zhì)的消化吸收,昆蟲(chóng)與甲殼動(dòng)物的蛻殼及孵化過(guò)程中起著(zhù)重要的作用.1986年,Koga等報道分別從家蠶表皮層和消化道中純化得 NAGase,并通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現分布在表皮層的酶與其蛻皮生長(cháng)成蟲(chóng)化蛹有關(guān),并受蛻皮激素調節;而分布在內臟的酶其主要功能是消化含幾丁質(zhì)的食物,與蛻皮生長(cháng)無(wú)關(guān)2.最近,黃小紅也報道了棉鈴蟲(chóng) NAGase的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)黃粉蟲(chóng)( Tenebrio molitor linneeus)富含蛋白質(zhì)氨基酸、人體必需的不飽和脂肪酸、甲殼多糖等,是一種極具潛力和前途、經(jīng)濟的資源,被專(zhuān)家稱(chēng)為是繼蜜蜂、家蠶之后第三大昆蟲(chóng)產(chǎn)業(yè),但關(guān)于黃粉蟲(chóng) NAGase還未見(jiàn)報道本文以黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)為研究材料,分離提取其 NAGase.以巰基乙醇為效應物,研究它對 NAGase酶活力的影響.這將有助于了解黃粉蟲(chóng) NAGase三維空間結構與酶活力關(guān)系;利用酶促反應動(dòng)力學(xué)原理研究巰基乙醇對酶的抑制類(lèi)型及抑制常數的計算將有助于了解酶的催化機制及酶活力的調控,為酶的結構與功能研究奠定基礎,在酶學(xué)理論研究上具有重要的意義.收稿日期:2006-04-25作者簡(jiǎn)介:謝曉蘭(1974—),女,福建惠安人,講師,博士,從事有機化學(xué)、生物化學(xué)方面的研究資助項目:福建省教育廳科技計劃項目(JA04260)102泉州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué))2006年7月1材料與方法1.1材料黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)購自廈門(mén)花鳥(niǎo)市場(chǎng)實(shí)驗室飼養后取樣冷凍備用對硝基苯N乙酰D氨基葡萄糖苷酶( PNP-NAG)為上海醫藥工業(yè)研究院產(chǎn)品;考馬斯亮藍試劑(G250)結晶牛血清白蛋白分別是上海藍季科技發(fā)展有限公司進(jìn)口分裝、國產(chǎn)分裝;三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)等其他生化試劑均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);疏基乙醇及其它化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純;所用蒸餾水為單蒸水1.2方法1.2.1黃粉蟲(chóng) NAGase的提取以黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)為提酶的材料,稱(chēng)取定量的冷凍黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)研磨成漿后,按3:1(V/W)的比例加入預冷的0.05mo/LpH=7.50 Tris-HCl緩沖液,置4C下抽提1h.4C、15000rpm離心30mn,虹吸中層清液,棄去沉淀與表層漂浮的油脂.往所得清液中加入研細的固體硫酸銨粉末至30%的飽和度,4℃下鹽析4h,4℃、15000rpm離心30min,虹吸中層清液,棄去沉淀雜蛋白與表層漂浮的油脂緩慢追加研細的硫酸銨粉末至70%的飽和度,4℃下鹽析4h,4℃、15000rpm離心30min,棄上清液,收集沉淀,沉淀用少量0.05mol/L、pH=7.50 Tris-HCl緩沖液溶解,并在4℃冰箱中對此緩沖液進(jìn)行透析,直到SO3被檢測出為止,透析液于4C、15000rpm離心30min,收集得酶活力為246u/ml,比活力為1025u/mg的酶制劑1.2.2酶蛋白濃度的測定見(jiàn)文獻[5]方法,以結晶牛血清白蛋白作標準曲線(xiàn),采用考馬斯亮藍染色結合法測定蛋白質(zhì)濃度1.2.3酶活力的測定酶活力的測定見(jiàn)文獻[6]體系含0.25mmol/L的底物,加入50l(酶蛋白濃度為240g/ml)粗酶液,準確反應后在721E型可見(jiàn)分光光度計上測定波長(cháng)為405nm的吸光度,以pNP為產(chǎn)物對照測得該條件下產(chǎn)物的消光系數為1.73L/( mol cm)酶活力單位定義為在上述條件下,每分鐘水解底物產(chǎn)生1mol/L產(chǎn)物的酶量1.2.4酶催化 PNP-NAG水解的動(dòng)力學(xué)參數測定采用以上酶活力測定的方法,改變底物濃度[S],測定酶促反應的初速度v,以v對[S]作圖,為典型的米氏雙曲線(xiàn)關(guān)系,采用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖,以1/v對1/[S]作圖,從直線(xiàn)的截距求得該酶催化 PNP-NAG水解的米氏常數Kn和最大反應速度Vn1.2.5巰基乙醇對酶活力作用的測定采用以上酶活力測定的方法,在測活體系中,加入不同濃度的巰基乙醇測定出酶的相對活力,分析它們對酶活力的影響1.2.6巰基乙醇對酶活力的抑制常數測定采以上酶活力測定的方法,固定底物濃度為0.25mmol/L,含不同濃度的巰基乙醇測活體系中,研究酶量與酶活力的關(guān)系,分析它們對酶的抑制機理;抑制類(lèi)型的判斷是采用1.2.4方法,通過(guò) Lineweaver-Burk雙倒數作圖,比較酶催化反應的動(dòng)力學(xué)參數,包括表觀(guān)米氏常數(Km)和最大反應速度(Vn)的變化2結果2.1酶催化 PNP-NAG水解的動(dòng)力學(xué)參數的測定用1.2.4方法,測定黃粉蟲(chóng) NAGase粗酶制劑在pH5.2的緩沖體系下,催化 PNP-NAG第4期謝曉蘭等:巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase活力的影響103水解的動(dòng)力學(xué)參數.如圖1所示,酶促反應初速度與底物濃度成典型雙曲線(xiàn)關(guān)系,說(shuō)明酶催化PNP-NAG水解反應遵循米氏方程,以 Lineweaver-Burk雙倒數法作圖,得到一條直線(xiàn),由直線(xiàn)橫軸截距求得在pH52的測活體系下,酶水解 PNP-NAG的Km值為0384mmol/L,Vn為31.2mol/L/min00602040.66810[s]/ mmol.·L圖1黃粉蟲(chóng) NAGase催化 pNP-NAG圖2巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase活力的形響水解反應的動(dòng)力學(xué)參數測定2.2巰基乙醇對酶活力的影響以巰基乙醇為效應物,在0.0~20.0%濃度范圍內研究其對酶活力的影響,結果見(jiàn)圖2圖2表明巰基乙醇對該酶活力的影響呈近S型的下降趨勢,剛開(kāi)始,巰基乙醇對酶活力的抑制較輕微,隨著(zhù)濃度的增髙,酶活力下降幅度增大,當達到高濃度時(shí),酶活力下降趨于平穩.其致使酶活力下降一半所需的濃度(IC50)約為6.0%,當殖基乙醇的濃度為20.0%時(shí),它可以使酶活力下降95%左右.2.3巰基乙醇對酶的抑制失活作用以巰基乙醇為效應物,在含0.25mmol/ L PNP-NAG和不同濃度巰基乙醇的測活體系中,改變酶量,測定酶催化反應的活力圖3表示酶的剩余活力與酶量的關(guān)系,結果表明:酶活力對酶量作圖得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn),隨著(zhù)巰基乙醇濃度的增高,直線(xiàn)的斜率降低.說(shuō)明在考察的濃度范圍內,巰基乙醇對酶的抑制失活作用是可逆過(guò)程,巰基乙醇通過(guò)抑制酶活力而導致催化效率的降低,而不是通過(guò)降低有效的酶量導致活力的下降2.4巰甚乙醇對酶的抑制失活作用類(lèi)型及抑制常數的測定在測活體系中,固定加入的酶量,改變底物濃度,測定不同濃度巰基乙醇對酶活力的影響,以 Lineweaver-Burk雙倒數作圖,判斷巰基乙醇的抑制類(lèi)型,結果見(jiàn)圖4.由圖4可知,雙倒數作圖得到一組相交于第二象限的直線(xiàn),說(shuō)明巰基乙醇對酶的Km值和Vn均產(chǎn)生影響,v值隨著(zhù)巰基乙醇濃度的增大而減小,而K灬值隨著(zhù)巰基乙醇濃度的增大而增大.說(shuō)明巰基乙醇對 NAGase的抑制作用表現為混合型抑制作用,巰基乙醇既影響酶的催化反應又影響了酶與底物的親和力以雙倒數圖的各直線(xiàn)斜率及縱軸截距分別對巰基乙醇濃度作圖,均為一直線(xiàn),測定其對游離酶的抑制常數K1與對酶-底物絡(luò )合物的抑制常數Ks分別為1.9%、9.6%104泉州師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué))2006年7月0600.50150.40004051015200.060043.00.10002010203040500[E]/μLs]/ moli·L圖3巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase失活作用機圖4巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase抑制作用類(lèi)型的判斷理的判斷,直線(xiàn)0-4的巰基乙醇濃度分直線(xiàn)0-4的筑基乙酵濃度分別為:0,5%,7.5%,別為:0,5%,7.5%,10%12.5%10%,12.5%.3討論昆蟲(chóng) NAGase主要分布在消化道及外殼膜,能催化幾丁質(zhì)的降解和合成,在昆蟲(chóng)的生長(cháng)發(fā)育、形態(tài)變化過(guò)程中舊殼的蛻換及新殼的形成起著(zhù)重要作用.本文以具有廣闊開(kāi)發(fā)應用前景的黃粉蟲(chóng)為材料,經(jīng)0.05ml/L、pH7.5 Tris-hCl緩沖液抽提、硫酸銨分級沉淀等生物分離技術(shù)制得酶蛋白濃度為240g/ml的粗酶制劑.在pH5.2、0.1mol/ L NaAc-HAc緩沖液的測活體系下,對黃粉蟲(chóng) NAGase催化 pNP-NAG水解反應的動(dòng)力學(xué)參數進(jìn)行了測定,得出米氏常數Kn=0.384mmol/L;同樣溫度下,在pH5.2、0.15mol/ L NaAc-HAc緩沖液下,測得凡納對蝦( Penaeus vannamei Prawn) NAGase催化 PNP-NAG水解反應的米氏參數Kn為0.254mmol/L;在pH5.8、0.05mol/ L NaAc-HAc緩沖液下,測得鋸緣青蟹(Sylaserrata) NAGase催化 PNP-NAG水解反應的Kn為0.424mmol/L;在pH5.6、0.1mo/LNaH2PO4Na2HPO緩沖液下,測得棉鈴蟲(chóng)( Helicoverpa armigera)蛹 NAGase催化pNPNAG水解反應的Kn為0.160mmo/L3.可見(jiàn),不同來(lái)源的同種酶具有不同的催化動(dòng)力學(xué)特性,比較三種不同來(lái)源的酶的米氏常數,結果顯示黃粉蟲(chóng) NAGase對底物 PNP-NAG的親和力比棉鈴蟲(chóng)和凡納對蝦 NAGase低,但比鋸緣青蟹 NAGase高.巰基乙醇是維持酶蛋白三級結構二硫鍵的主要修飾劑80,它的導入可導致酶蛋白二硫鍵被破壞,引起酶三維結構的松散導致酶的變性失活.不同的酶由于結構不同,引起變性失活所要求的巰基乙醇的濃度也不盡相同本文的實(shí)驗結果顯示巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase活力的影響呈近S型的下降趨勢,小濃度的巰基乙醇破壞酶三級空間結構的表面二硫鍵,這些二硫鍵對酶活性中心的影響不大,酶活性中心處于酶整體結構的內部.進(jìn)一步研究巰基乙醇對酶的失活作用動(dòng)力學(xué)結果顯示巰基乙醇讓酶產(chǎn)生可逆的混合型抑制失活.并測其對游離酶及酶底物絡(luò )合物的抑制常數,結果顯示K1值小于Ks值,顯示底物對酶的失活具有一定的保護作用第4期謝曉蘭等:巰基乙醇對黃粉蟲(chóng) NAGase活力的影響105參考文獻[1 Broadway RM, williams DL, KaIn WC, et al. 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The hydrolysis of pNP-NAG by NAGase follows Michaelis-Menten kinetics. The kinetic parameters for NAGase obtained from a lineweaver-Burk plot showed thatK. was equal to 0. 384 mmol/L. Effects of mercaptoethanol on NAGase were investigatedThe result showed mercaptoethanol easily made enzyme inactivate. The inhibitory kinetics ofmercaptoethanol on the enzyme was further studied. The result showed that it was reversiblemixed typed inhibitor of the enzyme. The inhibition constants of mercaptoethanol for NA-Gase K, and K Is were determined to be 1. 9% and 9. 6%, respectively.Key words: Tenebrio molitor Linneeus i NAGase; mercaptoethanol; inhibitory mechanism