螺旋藻乙醇酸氧化酶(GO)的研究

微生物學(xué)通報2005年32(4)螺旋藻乙醇酸氧化酶(GO)的研究王志忠鞏東輝劉華喬辰(內蒙古農業(yè)大學(xué)農學(xué)院呼和浩特010019)摘要:采用比色法對鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻(S)與國外引進(jìn)的鈍頂螺旋藻(S2)和極大螺旋藻(S3)的乙醇酸氧化酶(GO)進(jìn)行了比較研究。結果表明:在25℃pH8.0條件下,S1、S2和S3的CO活性分別為70.9U/gFW、59.6U/gFW和80.9U/gFW最適溫度均為30℃;在0℃~35℃(30℃)范圍內比較穩定;最適p值分別為86、8.2和8.4;pH值穩定范圍,S1為76-10.0、S2為80-9.0;S3為8.0-8.6。S1的CO對溫度和pH適應范圍最寬,且在低溫、高溫、強酸和強堿下的活性均比引進(jìn)種的高。關(guān)鍵詞:螺旋藻,乙醇酸氧化酶,酶動(dòng)力學(xué),鄂爾多斯高原堿湖中圖分類(lèi)號:Q554.9文獻標識碼:A文章編號:0253-2654(2005)04406804Study on Glycolic Acid Oxidase(GO)of Spirulina(Arthrospira)WANG Zhi-Zhong GONG Dong-Hui LIU Hua QIAO ChenDepartment of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University, Huhehaote 010019)Abstract: A comparative study on the glycolic acid oxidase(Go)of the domestic Spirulina( Arthrospira)plat-ensis(S, )from alkaline lake in Erdos Plateau and the imported S.(A.)platensis(S2)and S.(A)maxima(S,)as well is made with colorimetric method. The results show that activity of Go(25C, pH8. 0)of S,, s2and S, is 70.9 U/gFW, 59.6 U/gFW and 80.9 U/gFW respectively: the GO,'s optimum temperature of $1, S2and S is 30C: the GO,s optimum pH value of $, is 8.6, while that of S8. 2 and that of S3 8. 4: the Go of Sis stable from0℃to35℃ and from pH7.6topH10.0, while that of s.2 from 0℃to30℃ and from pH8.0topH 9.0 and that of S, from 0C to 35C and from pH 8. 0 to pH 8. 6. Adaptive range of $, Go for temperatureand ph is wider, and activity at low and high temperature and under strong acidand alkali conditions is higherKey words: Spirulina(Arthrospira), Glycolic acid oxidase(GO), Enzyme kinetics, Alkaline lake in Erdos乙醇酸氧化酶( Glycolic acid oxidase,簡(jiǎn)寫(xiě)GO)(EC1.1.3.15)廣泛存在于光合生物中,是光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶,其活性高低與光呼吸強弱呈正相關(guān)。研究證明光呼吸釋放的CO2約占C3植物凈光合速率所同化CO2的20%~50%,這對植物的生長(cháng)和干物質(zhì)積累都有很大的影響。因此,研究乙醇酸氧化酶無(wú)論是篩選低光呼吸品種,還是調控光呼吸代謝均具有重要意義。螺旋藻是一類(lèi)光合放氧的絲狀藍藻,屬于C3植物。其富含優(yōu)質(zhì)蛋白(60%70%)和多種生物活性物質(zhì),是人們廣泛接受的功能性食品之一3。目前,有關(guān)螺旋藻生長(cháng)和光合作用等研究較多,但酶的研究相對較少,特別是有關(guān)GO的研究未見(jiàn)報國家自然科學(xué)基金項目(No.30460104)內蒙古自然科學(xué)基金項目(No9903034)通訊作者Tel:047146946216,E-mail:qiao-chen@shu.com收稿日期:2004-10-13,修回日期:2004-12012005年32(4)微生物學(xué)通報道。本文以鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻與國外引進(jìn)種為材料,對其乙醇酸氧化酶進(jìn)行了比較研究,一則豐富該地區螺旋藻種質(zhì)資源的基礎研究;二則為已初具規模的鄂爾多斯高原螺旋藻產(chǎn)業(yè)篩選低光呼吸品種提供理論依據。1材料與方法1.1材料實(shí)驗材料見(jiàn)表1。表1實(shí)驗材料一覽表樣品物種產(chǎn)地(來(lái)源)鈍頂螺旋藻鄂爾多斯高原巴彥淖爾堿湖Spirulina( Arthrospira) platensis(內蒙古農業(yè)大學(xué))鈍頂螺旋藻非洲Chad湖S.(A)platensis(南京大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系)極大螺旋藻墨西哥 Sosa Texcoco湖S.(A)maxima(南京大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系)注:下文對應樣品以此表為準1.2方法121藻的培養:采用 zarrouk培養液在室溫自然光照下通氣培養。1.2.2粗酶液制備:準確稱(chēng)取處于對數生長(cháng)期新鮮藻3g,置于預冷研缽中,加人少許pH8.0的磷酸緩沖液及石英砂,在冰浴中研磨成勻漿,離心5min(3,500r/min)取上清液定容至20mL備用123Go活性測定:采用比色法,略有改動(dòng)。以△0.01Aa/min所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。1.2.4溫度對GO影響:在0℃~96℃和pH8.0的0.1mo/L的磷酸緩沖液條件下分別測定酶活性,繪制酶活性-溫度曲線(xiàn);將酶液在上述各溫度條件下保溫15min,后在25℃下測定酶活性,繪制酶穩定性一溫度曲線(xiàn)。每個(gè)處理重復3次。1.2.5pH值對GO影響:在pH2.6~12.0范圍內分別測定酶活性,pH2.6~7.0用檸檬酸-磷酸緩沖液,pH7.6~9.0用硼酸-硼砂緩沖液,pH10.0~12.0用磷酸氫二鈉和NaOH調配成的,繪制酶活性-pH值曲線(xiàn)。將酶液在各相應的pH條件下保溫15min,在25℃時(shí)測定酶活性,繪制酶穩定性-pH曲線(xiàn)。每個(gè)處理重復3次2結果與分析2.1螺旋藻Go活性在25℃、pH8.0時(shí), Sosa Texcoco湖的極大螺旋藻(S3)GO活性(80.9U/gFW)最高,鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻(S1)活性(70.9U/gFW)居中,Chad湖的鈍頂螺旋藻(S2)活性(59.6U/gFW)最低,且鈍頂螺旋藻(S1、S2)GO活性均低于極大螺旋藻。2.2溫度對螺旋藻GO的影響溫度對螺旋藻GO活性的影響見(jiàn)圖1。螺旋藻GO活性呈鐘形曲線(xiàn),最適溫度為微生物學(xué)通報2005年32(4)30℃,此時(shí)S1、S2和S3的GO活性分別為81.5U/gFW、67.5U/gFW和98.5U/ghW。在0℃和96℃下,鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻S1的CO活性均高于引進(jìn)種,說(shuō)明其對低溫和高溫的忍受能力最強(表2)溫度對螺旋藻CO穩定性的影響見(jiàn)圖2。鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻S3和SosTexcoco湖的極大螺旋藻S3的GO在0℃~35℃范圍內比較穩定,Chad湖的鈍頂螺旋藻的GO在0℃~30℃比較穩定,S1和S3的GO熱穩定范圍比S2寬5℃。在溫度穩定性范圍內,GO活性高低排列順序為S3>S1>S2;當溫度超過(guò)35℃(或30℃)以后,GO穩定性均明顯下降,在3個(gè)樣品中S2的CO穩定性最差。在96℃下,3個(gè)樣品GO穩定性均下降到最低,但S1比引進(jìn)種的略好。10008m0已500001001020253035405060708090960102025303540506070809096r/℃圖1螺旋藻GO溫度曲線(xiàn)圖2螺旋藻GO熱穩定性曲線(xiàn)表2在極端和最適的溫度、pH值下螺旋藻GO活性的比較活性最大活性最大活性最大152/S3(U/gFW)活性%(U/gW)活性%(U/gFW)活性%8.8溫度(℃)3064.017.026.610.011.34.05.71.74,32.65.07.12.04.34最適70.91.211.0l1.115.75.49.012.32.1.1注:S1/S2和S1/S3是指酶活性之比2.3pH值對GO活性的影響螺旋藻GO活性隨pH值的變化見(jiàn)圖3。3個(gè)樣品GO的最適pH值在8.2~8.6之間,其中S1為8.6,活性為70.9U/gFW;S2為8.2,活性為60.2U/gFW;S3為8.4,活性為80.6U/gFW。當pH≥9.0時(shí),S的GO活性均比引進(jìn)種的高(表2),說(shuō)明鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻GO比引進(jìn)種有較強耐堿性。在pH2.6和pH12.0時(shí),螺旋藻GO活性均很低,甚至有的已失活。螺旋藻GO的pH值穩定性見(jiàn)圖4。3個(gè)樣品的pH值穩定性曲線(xiàn)均呈不等腰梯形穩定范圍不盡相同,S1在pH7.6~10.0;S2在pH8.0~9.0;S3在pH8.0~8.6。鄂2005年32(4)微生物學(xué)通報爾多斯高原鈍頂螺旋藻SGO的pH穩定范圍最寬,Chad湖的鈍頂螺旋藻S2次之,SosaTexcoco i湖的極大螺旋藻S3最窄。在穩定范圍內,GO活性強弱排列為S>S1>S2900800007030c200040001026406.07.6828.610.012.02.64.06.07.68.28.610.012.0圖3螺旋藻GO活性pH曲線(xiàn)圖4螺旋藻GO活性pH穩定性曲線(xiàn)S1,-0-S2S1,0-S2,▲S33討論從總體上看,Chad湖的鈍頂螺旋藻GO的活性最低,鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻居中, Sosa texcoco湖的極大螺旋藻最高。我們在培養液溫度228℃~25.0℃、光強31-233μmo/m3s下,Chad湖的鈍頂螺旋藻凈光合速率最高,鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻次之, Sosa texcoco湖的極大螺旋藻最低(待發(fā)表)。由此看出,螺旋藻GO活性與凈光合速率存在負相關(guān)。但CO活性對螺旋藻光呼吸、凈光合速率及產(chǎn)量的影響程度仍有待于進(jìn)一步研究。鄂爾多斯高原堿湖的鈍頂螺旋藻GO對pH值適應范圍較引進(jìn)種的寬;在強堿下的活性也較髙,這與其所處環(huán)境有關(guān)。鄂爾多斯高原位于世界鹽堿湖帶上,其鹽堿湖面積小,湖表鹵水的水位、礦化度和化學(xué)成分受地質(zhì)條件、大氣降水、風(fēng)力和蒸發(fā)作用等自然因素的影響6。該地區年降水量為250~360mm;年蒸發(fā)量為2470mm~2691mm,蒸發(fā)量是降水量的7~11倍;風(fēng)多風(fēng)大,年平均風(fēng)速3.5m/s,最大風(fēng)速28m/s,揚沙日數40~50d/a,沙暴日數12~16d/a。堿湖多數年份有湖表鹵水但當氣候連續干旱時(shí),也會(huì )出現干涸。所以受當地地質(zhì)和氣候條件的影響,湖水的pH值高且波動(dòng)比較大。在這樣堿湖中生存的螺旋藻經(jīng)過(guò)長(cháng)期的自然選擇,表現出對pH值變化范圍寬和高pH環(huán)境的適應性。致謝引進(jìn)的鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻由曾昭琪教授惠贈,特此致謝。參考文獻[1]王煒軍,彭新湘,李明啟.華南農業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,20(3):117-122[2]孟繁靜,劉道宏,蘇業(yè)瑜.植物生理生化.北京:中國農業(yè)出版社,199171[3]汪志平,錢(qián)凱先,微生物學(xué)通報,200,27(4):288-291[4] Zarrouk C. 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