生物質(zhì)譜的研究及其應用

2004年1月重慶大學(xué)學(xué)報第27卷第1期Journal of Chongqing UniversityVol 27 No. 1文章編號:1000-582X(2004)01-0123-05生物質(zhì)譜的研究及其應用吳世容2,李志良,李根容,楊勝喜(1.重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶400044;2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶400044)摘要:發(fā)展生物質(zhì)譜是為解決生命科學(xué)中有關(guān)生物物質(zhì)分析問(wèn)題,主要借助軟電離質(zhì)譜技術(shù)對生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和多糖等進(jìn)行結構分析。生物質(zhì)譜已成為質(zhì)譜學(xué)中最活躍的研究領(lǐng)域,推動(dòng)了質(zhì)譜分析理論和技術(shù)的發(fā)展。筆者簡(jiǎn)要介紹了生物質(zhì)譜的發(fā)展,重點(diǎn)討論因“發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法”而榮獲2002年諾貝爾化學(xué)獎金一半的美國科學(xué)家約翰.芬恩教授( John B.Fen)和日本科學(xué)家田中耕一工程師( Koichi tanaka)分別研發(fā)的電噴霧電離質(zhì)譜(ESⅠ-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜( MALDI-MS)特別闡述它們應用于蛋白質(zhì)、核酸和糖結構分析及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)等生物組學(xué)和化學(xué)組學(xué)中關(guān)鍵詞:生物質(zhì)譜;蛋白質(zhì);核酸;多糖;基因組學(xué);蛋白質(zhì)組學(xué);糖組學(xué)中圖分類(lèi)號:O657.6;O642.2;R917.1文獻標識碼:A2002年度諾貝爾化學(xué)獎授予了三位在生物大分質(zhì)譜分析問(wèn)題。近年來(lái)涌現出較成功地用于生物大分子研究領(lǐng)域作岀突岀貢獻的科學(xué)家以表彰他們開(kāi)創(chuàng )了子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種:1)電噴霧應用儀器分析法對于生物大分子進(jìn)行確認和結構分析電離質(zhì)譜;2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜;3)快原子轟的方法。其中約翰.芬恩( John F.Fenn)和田中耕擊質(zhì)譜;4)離子噴霧電離質(zhì)譜;5)大氣壓電離質(zhì)譜。在( Koichi tanaka)各得獎金的1/4(共分享1/2),主這些軟電離技術(shù)中,以前面三種近年來(lái)研究得最多,應要貢獻是“發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認和結構分析用得也最廣泛。筆者主要討論在生物大分子分析方面的方法”及“發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法”。隨的研究與應用著(zhù)生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展,為了解決生命科學(xué)過(guò)程中的有關(guān)生物活性物質(zhì)的分析問(wèn)題而發(fā)展并推1電噴霧電離質(zhì)譜動(dòng)了生物質(zhì)譜。生物質(zhì)譜目前已成為有機質(zhì)譜中最活電噴霧電離(ESⅠ)是一種“軟”電離技術(shù),起源于躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之它的發(fā)展1917年,但它用于質(zhì)譜乃80年代事(見(jiàn)圖1電噴霧電強有力地推動(dòng)了人類(lèi)基因組計劃及其后基因組計劃的離質(zhì)譜)。1984年3-美國耶魯大學(xué)化工系教授約提前完成和有力實(shí)施。生物質(zhì)譜主要用于解決兩個(gè)分翰.芬恩( John B.Fenn)研究組等首次發(fā)表了ESI析問(wèn)題:精確測量生物大分子,如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖MS實(shí)驗結果,并于4年后報道首次成功運用ESI類(lèi)等的分子量,并提供分子結構信息;對存在于生命復MS分析蛋白質(zhì)。ESl-MS既可分析大分子也可分析雜體系中的微量或痕量小分子生物活性物質(zhì)進(jìn)行定性小分子。對于分子量在1000Da以下的小分子,會(huì )產(chǎn)或定量分析。業(yè)已發(fā)展了各種新軟電離技術(shù)及聯(lián)用技生M十H十或M一N]一離子,選擇相應的正離子或術(shù),擴展了質(zhì)譜可測質(zhì)量范圍,特別是色譜一質(zhì)譜聯(lián)用負離子形式進(jìn)行檢測,就可得到分子量。而高達技術(shù)和質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)。在此,主要討論生物大分子的子在 ESI-MS中生成一系列多電荷離中國煤化工CNMHG收稿日期:2003-0基金項目:霍英東基金[98]與國家“春暉計劃”教育部啟動(dòng)基金[99、國家新藥基金[97]及重慶市應用基礎課題[01資助課作者簡(jiǎn)介:吳世容(1979—),女,四川什邡人,分析化學(xué)2002級研究生;研究方向:天然藥物分離分析;生物譜學(xué)分析;化學(xué)生物藥學(xué)分析、綠色化學(xué)及分析技術(shù)。124重慶大學(xué)學(xué)報2004子,通過(guò)數據處理系統能夠得到樣品的分子量,準確度為質(zhì)子轉移和堿金屬加合等?；|(zhì)必須滿(mǎn)足一些共優(yōu)于0.01%。這些離子(m/z)以“表觀(guān)”質(zhì)量數岀現在性:在合適溶劑中溶解性能,對激光吸收性能,合適反譜圖,與分子量有密切關(guān)系。據報道,ESI-MS通過(guò)應活性,首先基質(zhì)必須在蛋白質(zhì)溶劑中有好溶解性,常多電荷離子已能測岀分子量達13300Da蛋白質(zhì)3-3用蛋白質(zhì)溶劑有鹽酸水溶液,水一乙氰/乙醇混合物,或200000Da糖蛋白。ESI-MS或與HPIC聯(lián)0%甲酸。其次必須能很好地吸收激光,以使能量沉用可進(jìn)行蛋白質(zhì)序列和構象分析,酶反應中間體分析積在基質(zhì)中而非分析物上。另外基質(zhì)反應活性必須考酶抑制劑機理分析、共價(jià)或非共價(jià)復合體分析等方面慮:能對蛋白質(zhì)或其他分析物起共價(jià)修飾或氧化作用均獲得應用。有人預測用用ESI可側得數MDa分子的基質(zhì)不能采用。近期有關(guān)基質(zhì)研究仍很活躍,是量的蛋白質(zhì)-。熱點(diǎn)。用 MALDI-MS分析多肽及蛋白質(zhì)時(shí),當基質(zhì)選擇妥當之后即著(zhù)手準備樣品。 Tanaka等6把待測多肽溶于甘油中,并與很細金屬粉未混合,然后把懸浮液滴到探頭上,讓激光照射,再進(jìn)入質(zhì)譜分析。甘油對377nm激光透明,激光與甘油不發(fā)生作用,因此引入PrR金屬粉未在溶液中形成吸收中心。 Hillenkamp等認為激光解吸時(shí)是底物吸收激光,選擇合適基質(zhì)使之與樣品混合就可測量大分子物質(zhì),并提出“基質(zhì)輔助激光解吸”名稱(chēng)。直到選用煙酸作為基質(zhì)才有突破,煙酸圖1電噴霧電離質(zhì)譜和蛋白質(zhì)混合溶液滴到探頭上,干后用激光照射可得蛋白質(zhì)分子離子信號。 Tanaka法靈敏度為109mol數量級,受關(guān)注則相對不多; Hillenkamp法靈敏度達10-1mol量級,信號強且信噪比高因而被廣泛采用,高靈敏度優(yōu)點(diǎn)顯著(zhù),樣量只需1pmol甚至更少3快原子轟擊質(zhì)譜鑒于分析樣品一般都偶極矩大的分子,基質(zhì)表面準分子離子受到Ar快原子流轟擊接受能量,解吸脫離液面濺入氣相中。FAB-MS譜中主要出現準分子離子峰而少出現分子離子峰,且在基質(zhì)加入酸或堿2基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜或鹽使相應準分子離子強度增大。當然也不排除在氣2基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜相中濺出樣品分子受轟擊產(chǎn)生分子離子,但豐度比準分子離子小得多。由于電離未受加熱,所以FAB電離激光解吸電離質(zhì)譜(LD-MS)早被作為分析難技術(shù)特別適合于熱不穩定高極性化合物,如蛋白質(zhì),核揮發(fā)有機物手段,曾用于分析合成聚合物和熱不穩定酸及糖類(lèi)等,測出的質(zhì)量數上限已可達到10Da。因生物小分子。但K可測分子量均低于3kDa,對生物結構簡(jiǎn)單而信號持續和重現性好等特點(diǎn),便于推廣,故大分子測定受到很大限制。直到1988年 Tanaka和仍是常用重要的質(zhì)譜手段Hillenkamp兩個(gè)研究組分別提出基質(zhì)輔助激光解4多肽和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析吸電離質(zhì)譜( MALDI-MS,見(jiàn)圖2基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜)后才使LDI-MS應用于生物大分子分蛋白質(zhì)是生物體中含量最高功能最重要的生物大析得到發(fā)展-7。 MALDI-MS分析蛋白質(zhì)的關(guān)鍵分子中國煤化工占細胞干質(zhì)量50%以是選擇合適的基質(zhì)首先基質(zhì)相當于溶劑樣品分子被上,在CNMHG由多個(gè)氨基酸組成肽基質(zhì)彼此分開(kāi),這種分離削弱了樣品分子間相互作用;則稱(chēng)為多肽或為數不大時(shí)稱(chēng)為寡肽,組成氨基酸單元然后基質(zhì)從激光脈沖中吸收能量并轉化為固溶體系激稱(chēng)為氨基酸殘基。多肽廣存于自然界,最重要的是作發(fā)能產(chǎn)生瞬間相變,離子形成過(guò)程有兩臨界值:低表面為蛋白質(zhì)亞單位。蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方解吸而高本體解吸給岀離子信號?；|(zhì)能量傳遞機制式組合的生物大分子,復雜結構主要包括以肽鏈為基第27卷第1期吳世容等:生物質(zhì)譜的研究及其應用125礎的肽鏈線(xiàn)型序列[稱(chēng)為一級結構]及由肽鏈卷曲折疊后推導整個(gè)蛋白質(zhì)序列而形成三維[稱(chēng)為二級,三級或四級]結構。目前質(zhì)譜5核酸質(zhì)譜分析主要測定蛋自質(zhì)一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置。1981年首先采用生物高分子核酸( nucleic acid)存在于一切活細胞FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量,分析十一肽(Mr中,構成單位是核苷酸( nucleoticle)。核酸分為脫氧1318),質(zhì)譜中岀現準分子離子[M+1]=1319強峰。核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類(lèi)。DNA是譜中出現均為單電荷離子主要包括肽離子,甘油離子遺傳信息的載體,RNA在蛋白質(zhì)生物合成起重要作和甘油簇離子。FAB質(zhì)譜常用氬Ar作轟擊劑,但在用。近來(lái)發(fā)現質(zhì)譜是核酸一級結構分析最有利手段某些情況用氙ⅹe效果更好一點(diǎn)。FAB質(zhì)譜法既可測如核酸的核苷酸順序可表為5' PAPCPGPTPT3',若正離子譜也可測負離子譜,由于蛋白質(zhì)和多肽分子含僅關(guān)心堿基順序,則可寫(xiě)成5 ACGTI3′。需注意所表多個(gè)易質(zhì)子化部位所以一般測正離子譜,基質(zhì)加入酸示核苷酸順序是從左至右5→3′。多核苷酸片段一端可增強(M+1)+離子強度。分析疏水性肽常用極性為3一端另一端為5′一端;未端可以是不帶有磷酸基較小基質(zhì),測定負離子譜時(shí)則采用堿性液體作基質(zhì)。核苷3'或5′一羥基也可是核苷酸3′或5′一羥基帶有分子量小于6kDa肽或小蛋白質(zhì)合適用FAB質(zhì)譜分磷酸基團。各核苷酸分子及殘基沿序排列就是核酸析,更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用MALD質(zhì)譜或級結構,種類(lèi)不多但因核苷酸數目和排序不同而構成ES質(zhì)譜分析。用MALD〕-TOF質(zhì)譜分析蛋自質(zhì)最多種不同核酸。用質(zhì)譜測核酸一級結構,相當測定分早一例是 HillenKamp等于1988年提出用紫外激光子量和堿基序。以煙酸為基質(zhì)在TOF譜儀上測出質(zhì)量數高達60kDa質(zhì)譜曾用來(lái)測核酸分子量但較困難,其信噪比和蛋白質(zhì),精確度開(kāi)始只有0.5%,后改進(jìn)到0.1-0.分辨率一般較低。20世紀90年代初 MALDI-TOF2%。MALD-TOF質(zhì)譜所測質(zhì)量上限高、靈敏、迅質(zhì)譜分析核酸只含4~6個(gè)堿基、分子量為數kDa低速(